崔邁尹，付艷瓊，李卓麗，陳吳越，廖敏，陳佰慧

（1溫州醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，2溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，溫州 325035）

腦卒中是由腦部血液循環(huán)障礙引起的神經(jīng)功能缺陷疾病，具有高致殘、高致死的特點，已成為影響全世界人口健康和社會經(jīng)濟發(fā)展的重大問題[1]。腦卒中分為出血性和缺血性，其中缺血性腦卒中發(fā)生后，大腦內(nèi)氧糖供應(yīng)不足會引起神經(jīng)元的死亡并釋放大量炎癥因子，誘發(fā)神經(jīng)炎癥，進而加重神經(jīng)損傷程度[2]。腦缺血損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)與膠質(zhì)細胞的激活密切相關(guān)[3]。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常駐的免疫細胞。缺血性腦損傷發(fā)生后，小膠質(zhì)細胞從靜息狀態(tài)分別被激活為經(jīng)典激活型（M1型）和替代激活型（M2型），前者可分泌促炎因子，表達誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、加劇炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元損傷；而后者通過釋放抗炎因子、誘導(dǎo)分化簇206（cluster of differentiation 206，CD206）的表達進而抑制神經(jīng)炎癥引起的神經(jīng)損傷[4]。另外，星形膠質(zhì)細胞是腦缺血損傷后最早受損的膠質(zhì)細胞，可被激活為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞，釋放多種凋亡因子并異常增殖形成膠質(zhì)瘢痕，造成不可逆的組織功能損傷[5]。因此，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化是改善腦缺血損傷的一個重要途徑[3]。

大量研究發(fā)現(xiàn)達珀利奈[(E)-Daporinad，F(xiàn)K866]是一種自身免疫性疾病[6]和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[7]等多種炎性疾病的潛在治療藥物。最近，Sasaki等人證明FK866參與調(diào)控神經(jīng)組織損傷與修復(fù)過程，該研究發(fā)現(xiàn)FK866通過間接地抑制α和Toll/白細胞介素受體結(jié)構(gòu)域蛋白1[sterile alpha and toll/interleukin receptor (TIR) motif containing protein 1，SARM1]的表達來阻斷軸突變性，從而保護神經(jīng)元免受損傷，因此FK866也可作為SARM1的抑制劑[8]。Maynard等人發(fā)現(xiàn)在SARM1全敲小鼠的腦挫傷模型中，白質(zhì)損傷區(qū)域的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活性被減弱，炎癥反應(yīng)降低，同時改善運動和認知功能缺陷，對腦挫傷起到神經(jīng)修復(fù)作用[9]。然而，在缺血性腦卒中發(fā)生后FK866是否通過阻斷SARM1的活性，參與調(diào)控膠質(zhì)細胞活化并發(fā)揮神經(jīng)保護作用仍有待研究。

為了探究FK866在缺血性腦卒中急性期是否發(fā)揮神經(jīng)保護作用并分析其機制，本研究應(yīng)用光化學(xué)栓塞法制備小鼠局部缺血模型，模擬缺血性腦卒中的病理生理過程，檢測了FK866對急性缺血性腦卒中小鼠大腦皮層損傷、運動協(xié)調(diào)功能、腦內(nèi)缺血灶部位膠質(zhì)細胞的活化及SARM1表達的影響。

材料與方法

1 實驗動物及分組

選取8周齡成年雄性C57BL/6小鼠[購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，清潔級，許可證號：SYXK（浙）2015-0009]，體重22～28 g。全部傳入并飼養(yǎng)繁殖于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的SPF級動物實驗室，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制為22～25 ℃，濕度為50%～60%，光照12 h，飲水和進食自由。小鼠按隨機法分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血損傷手術(shù)組（Vehicle組）、缺血手術(shù)后給予FK866干預(yù)組（FK866組）。本研究動物實驗方案均得到了溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 動物模型

小鼠在注射10 mg/ml孟加拉紅溶液（100 mg/kg，Sigma）5 min后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，待其徹底麻醉后，將小鼠固定于腦立體定位儀（68025，RWD），用剃毛機將小鼠頭部毛發(fā)剃除，使用碘伏溶液消毒3次，自雙眼中間至雙耳中間縱向剪開頭皮暴露顱骨后，以前囟為基準(zhǔn)原點，缺血灶定位于左側(cè)初級體感皮層前肢區(qū)（primary somatosensory cortex, forelimb region，S1FL），將激光發(fā)光器（MBL-III-473/100，Coherent）調(diào)至波長473 nm、功率50 mW的激發(fā)光，照射15 min，光化學(xué)栓塞缺血手術(shù)完畢后縫合小鼠頭皮，置于37℃熱板復(fù)蘇。FK866組的小鼠，在手術(shù)當(dāng)天和術(shù)后1 d、2 d、3 d連續(xù)4天給藥，每天2次，腹腔注射溶于0.9%生理鹽水的FK866溶液（5 mg/kg，Sigma）。Vehicle組小鼠在相同時間腹腔注射同劑量的0.9%生理鹽水，Sham組小鼠接受相同手術(shù)過程，但不注射孟加拉紅溶液。

3 行為學(xué)試驗

小鼠分別在缺血手術(shù)前1 d以及手術(shù)后1 d和3 d進行行為學(xué)檢測，通過以下2種行為學(xué)試驗測定小鼠的運動功能。

3.1 圓筒試驗

圓筒試驗用來評估小鼠在直立狀態(tài)下自發(fā)性使用前肢的偏好。本研究中缺血病灶位于左側(cè)S1FL區(qū)，該區(qū)域損傷后會導(dǎo)致小鼠使用右側(cè)前肢的貼壁次數(shù)減少，損傷嚴(yán)重者甚至不使用右側(cè)前肢，而使用左側(cè)前肢的貼壁次數(shù)會增加，因此我們可以通過評估小鼠左側(cè)前肢的貼壁次數(shù)反應(yīng)其恢復(fù)情況。試驗在安靜環(huán)境下、小鼠最活躍的時間段19:00—22:00 進行；小鼠在透明有機玻璃的圓筒里（13.6 cm × 19.9 cm：直徑×高）一共3 min，全程錄像，圓筒后面設(shè)置玻璃以獲取小鼠背對攝像機的行為；小鼠在直立狀態(tài)下前肢接觸筒壁（以雙前肢放回地面為標(biāo)記）記為一組。左前肢貼壁率計算公式如下：

左前肢貼壁率=左前肢貼壁次數(shù)/(左前肢貼壁次數(shù)+右前肢貼壁次數(shù)+雙前肢貼壁次數(shù)）× 100%3.2 網(wǎng)格爬行試驗

網(wǎng)格爬行試驗用來評估小鼠前肢運動功能及協(xié)調(diào)性。左側(cè)S1FL區(qū)缺血損傷后會導(dǎo)致小鼠右側(cè)前肢的感覺運動障礙，小鼠的前爪無法進行正常抓握，因此我們可以通過評估小鼠右側(cè)前肢在網(wǎng)格爬行時掉落的次數(shù)反應(yīng)其運動恢復(fù)情況。試驗在安靜環(huán)境下、小鼠最活躍的時間段19:00—22:00進行；小鼠被放置在不銹鋼金屬籃筐（27.5 cm × 22 cm：直徑×高）里，將每格邊長為1 cm正方形不銹鋼金屬籃筐固定在實驗室工作臺上方約50 cm處，一共1 min，全程錄像，記錄小鼠的步行次數(shù)，計算右前肢掉落率：

4 尼氏染色

向小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，開胸，用靜脈輸液針由心尖插入到左心室內(nèi)通過蠕動泵驅(qū)動器（BT100-2J，蘭格）勻速注入0.01mol/L PBS緩沖液，然后以4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定。剝?nèi)∧X組織后，置于4%多聚甲醛溶液進行后固定，經(jīng)30%蔗糖脫水后用冰凍切片機（CM1950-1-0，Leica）作連續(xù)冠狀切片，切片厚度為30 μm。將腦切片放入PBS 溶液洗10 min×3次，放入55 ℃烘箱中干燥20～30 min；之后放入裝有0.1%尼氏染色液（C0117，碧云天）的染缸中，放置時間根據(jù)著色情況而定；放入95%乙醇中洗脫30 s，100%乙醇中脫水2 min，然后放入二甲苯中透明5 min×2次，中性樹膠封片，晾干后置于顯微鏡（Nikon）下拍照。

5 TUNEL染色與免疫熒光雙重染色

取出冰凍切片置于0.01 mol/L PBS中漂洗10 min×3次；腦片置于4%PFA中固定20 min后用PBS漂洗10 min×3次，用1×檸檬酸鈉抗原修復(fù)液于96 ℃水浴加熱6 min進行抗原修復(fù)，PBS漂洗10 min×3次；用3% H2O2-甲醇溶液10 min，將腦片置于含小鼠抗NeuN抗體（1:800，Abcam）溶液中4 ℃孵育過夜；次日用PBS溶液漂洗10 min×3次；按照TUNEL細胞凋亡試劑盒（No. 11684817910，羅氏）說明避光配制TUNEL反應(yīng)液，將盒中50 μL的脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）濃縮溶液加入到450 μL的FITC熒光素標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（2’-deoxyuridine-5’-triphosphate，dUTP）溶液里，充分混勻后加入相應(yīng)的含Alexa 594熒光素的驢抗小鼠二抗（1:1000，Jackson ImmunoReaserch）和細胞核標(biāo)記物DAPI（1:1000，Sigma）置于37 ℃恒溫烘箱避光孵育1 h；再用PBS溶液漂洗10 min×3次；滴適量抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡（Li2，Nikon）拍照。

6 免疫組織化學(xué)染色

取出冰凍切片置于0.01 mol/L PBS中漂洗10 min×3次；腦切片浸入0.3%H2O2-甲醇溶液中20 min，之后PBS漂洗10 min×3次；放入2.5% 正常羊血清封閉30 min，在分別含有兔抗離子化鈣結(jié)合適配體分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）抗體（1:1000，Abcam）、小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（1:50，Cell Signaling Technology）溶液中4 ℃孵育過夜；次日用PBS漂洗10 min×3次；二抗以相應(yīng)的含辣根過氧化物酶（HRP）的山羊抗兔/小鼠抗體（1:250，Abcam）室溫孵育1.5 h，PBS漂洗10 min×3次；浸入親和素-生物素過氧化酶復(fù)合物（avidin-biotinylated peroxidase complex，ABC）溶液（32020，Thermo Scientific）（1:100）反應(yīng)1 h，用PBS漂洗10 min×3次；再浸入3,3’-二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）溶 液（D8001，Sigma）顯色（時間可根據(jù)染色效果和要求調(diào)整），用PBS漂洗10 min×3次；放入55 ℃烘箱干燥；將切片分別浸入50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇中脫水5 min，二甲苯中透明5 min×2次，中性樹膠封片，晾干后顯微鏡（Nikon）下拍照。

7 蛋白免疫印跡

冰上剖取小鼠大腦，取大腦皮層缺血部位，于精細天平上稱量，每100 mg腦組織加1 mL 含蛋白酶抑制劑的組織裂解液，低溫快速勻漿，于冰上裂解30 min；于4 ℃、12000 r/min離心10 min；吸取上清，加入5×上樣緩沖液，吹打混勻，放入100 ℃干式金屬恒溫器（OSE-DB-01，天根）煮10 min；等量蛋白按順序上樣，經(jīng)8%-10% SDS-PAGE膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，再置于5%脫脂奶粉室溫封閉1～2 h，1×TBST漂洗10 min×3次；之后置于以下特異性一抗中4 ℃溫和孵育過夜：兔抗Iba1抗體（1:1000，Abcam），兔抗SARM1抗體（1:1000，Novus），小鼠抗GFAP抗體（1:1000，Cell Signaling Technology），小鼠抗iNOS抗體（1:1000，Abcam），山羊抗CD206抗體（1:1000，R&D System），小鼠抗膠質(zhì)瘢痕標(biāo)志物磷酸蛋白聚糖（phosphacan）抗體（1:1000，Sigma），小鼠抗β-actin抗體（1:3000，Abcam）；次日TBST漂洗10 min×3次；含HRP的山羊抗兔/小鼠抗體（1:5000，Abcam）以及含HRP的驢抗山羊抗體（1:5000，Abcam）室溫孵育1.5 h，TBST漂洗10 min×3次；根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（SQ201，雅酶）以1:1比例配制曝光液并均勻覆蓋在PVDF膜上，室溫下孵育1 min后于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiScope6000，勤翔）曝光并保存結(jié)果。

8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Prism 8軟件統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組間采用兩樣本t檢驗和單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 FK866抑制缺血性腦卒中小鼠神經(jīng)損傷

為了探究FK866在缺血性腦卒中誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷中的作用，應(yīng)用尼氏染色和TUNEL染色檢測大腦皮質(zhì)缺血病灶面積和神經(jīng)元凋亡水平。尼氏染色顯示：Sham組小鼠大腦皮層未見缺血病灶，Vehicle組小鼠大腦皮層可見大面積缺血病灶，F(xiàn)K866組小鼠大腦皮層缺血病灶面積較Vehicle組明顯縮??；TUNEL染色與NeuN免疫熒光染色顯示：Sham組小鼠大腦皮層未見或偶見TUNEL染色陽性神經(jīng)元，Vehicle組小鼠缺血灶內(nèi)可見大量TUNEL陽性的凋亡神經(jīng)元，而FK866組凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯少于Vehicle組（圖1），表明FK866干預(yù)可顯著抑制缺血對神經(jīng)元的損傷。

圖1 FK866對缺血性腦卒中小鼠皮層神經(jīng)損傷影響的尼氏染色與TUNEL染色檢測，箭頭示TUNEL染色陽性的神經(jīng)元Fig. 1 Nissl and TUNEL stainings to detect the effect of FK866 on the cortical neuronal injury in ischemic stroke mice, arrows show positive neurons with TUNEL staining

2 FK866改善缺血性腦卒中小鼠運動能力缺陷

應(yīng)用圓筒試驗和網(wǎng)格爬行試驗檢測小鼠運動功能顯示：Vehicle組小鼠神經(jīng)運動功能損傷明顯，圓筒試驗中左前肢接觸率和網(wǎng)格爬行試驗中右前肢掉落率較Sham組明顯增多。在缺血手術(shù)后1 d，F(xiàn)K866組小鼠運動神經(jīng)功能損傷癥狀較Vehicle組有所緩解，圓筒試驗中左前肢接觸率和網(wǎng)格爬行試驗中右前肢掉落率均較Vehicle組明顯減少。在缺血手術(shù)后3 d，F(xiàn)K866組小鼠較Vehicle組小鼠在圓筒試驗中左前肢接觸率和在網(wǎng)格爬行試驗中右前肢掉落率進一步減少（表1，表2）。

表1 FK866對缺血性腦卒中小鼠運動功能影響的圓筒試驗檢測Tab.1 Effect of FK866 on the motor function of ischemic stroke mice by cylinder test

表2 FK866對缺血性腦卒中小鼠運動功能影響的網(wǎng)格爬行試驗檢測Tab. 2 Effect of FK866 on the motor function of ischemic stroke mice by grid walking test

3 FK866抑制缺血性腦卒中后小膠質(zhì)細胞活化并促進其M2極化

為了闡明FK866對腦缺血損傷后神經(jīng)元和運動功能缺陷的保護作用所涉及的潛在機制，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測大腦皮層缺血灶及周圍的膠質(zhì)細胞活化情況。Iba1（小膠質(zhì)細胞標(biāo)記物）免疫組織化學(xué)染色顯示：Sham組Iba1標(biāo)記的小膠質(zhì)細胞呈分枝桿狀，胞質(zhì)較小，此為靜息小膠質(zhì)細胞；Vehicle組小鼠大腦皮質(zhì)缺血灶內(nèi)Iba1陽性小膠質(zhì)細胞免疫反應(yīng)性較Sham組顯著升高，多呈棕色顆粒狀的阿米巴樣，且胞質(zhì)增大，分支縮短變粗；然而，F(xiàn)K866組小鼠大腦皮質(zhì)缺血灶內(nèi)Iba1陽性小膠質(zhì)細胞免疫反應(yīng)性則明顯降低，可見少許體積變大，呈棕色顆粒狀的阿米巴樣小膠質(zhì)細胞（圖2A）。

因為各組皮層中小膠質(zhì)細胞的形態(tài)不一，提示可能是小膠質(zhì)細胞受不同刺激后的不同極化分型。由于小膠質(zhì)細胞處于M2型激活時也會發(fā)生阿米巴樣形態(tài)改變，但其作用為減輕炎癥反應(yīng)，因此應(yīng)用免疫印跡實驗檢測大腦皮層中缺血部位的Iba1、iNOS（小膠質(zhì)細胞M1型標(biāo)記物）和CD206（小膠質(zhì)細胞M2型標(biāo)記物）的蛋白表達水平。結(jié)果顯示：與Sham組相比，Vehicle組小鼠的大腦皮層缺血部位中Iba1的表達水平上升；與Vehicle組相比，F(xiàn)K866組小鼠大腦皮層缺血部位中Iba1和iNOS的表達水平降低，而CD206的表達水平上升（圖2B）。表明在缺血性腦卒中后，F(xiàn)K866抑制小膠質(zhì)細胞的活化并促進其向M2型極化。

圖2 FK866對缺血性腦卒中小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化的影響。A，Iba1表達水平免疫組織化學(xué)檢測與統(tǒng)計學(xué)分析；A1，Iba1表達的代表性免疫組織化學(xué)染色圖像；A2，Iba1表達的免疫組織化學(xué)染色強度的統(tǒng)計學(xué)分析；**P<0.01。B，CD206、iNOS和Iba1表達的免疫印跡法檢測與統(tǒng)計學(xué)分析；B1，CD206、iNOS和Iba1表達的代表性免疫印跡檢測結(jié)果；B2，CD206、iNOS和Iba1表達水平的統(tǒng)計學(xué)分析；*P<0.05，**P<0.01；n=4Fig. 2 Effect of FK866 on the activation of microglia in the brains of ischemic stroke mice. A, immunohistochemical detection and statistical analysis of Iba1 expression. A1, representative images of Iba1 immunohistochemical staining; A2, statistical analysis of the immunohistochemical staining intensity of Iba1 expression; **P<0.01. B, Western blot detection and statistical analysis of the expression of CD206, iNOS and Iba1; B1, representative Western blot results of CD206, iNOS and Iba1 expression; B2, statistical analysis of the expression level of CD206, iNOS and Iba1; *P<0.05, **P<0.01; n=4

4 FK866抑制缺血性腦卒中小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞活化及膠質(zhì)瘢痕的形成

GFAP（星形膠質(zhì)細胞標(biāo)記物）免疫組織化學(xué)染色顯示：Sham組GFAP免疫反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞散布在皮質(zhì)中，且胞質(zhì)較??；Vehicle組大腦皮質(zhì)缺血灶周圍可見大量GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞，較Sham組的免疫反應(yīng)性升高；與Vehicle組相比，F(xiàn)K866組小鼠大腦皮層缺血灶周圍GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞的免疫反應(yīng)性則明顯降低（圖3A）。

因為Vehicle組中GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞多聚集在缺血灶周圍并延伸出長突起，提示可能存在膠質(zhì)瘢痕的增生，應(yīng)用免疫印跡實驗檢測各組皮層缺血灶部位GFAP和膠質(zhì)瘢痕標(biāo)記物phosphacan[10]表達水平。免疫印跡實驗顯示：Vehicle組小鼠大腦皮層缺血部位GFAP和phosphacan表達水平明顯高于Sham組；與Vehicle組相比，F(xiàn)K866組小鼠大腦皮層缺血部位GFAP和phosphacan表達水平顯著降低，但仍高于Sham組（圖3B）。由此表明在缺血性腦卒中后，F(xiàn)K866可明顯抑制星形膠質(zhì)細胞激活以及膠質(zhì)瘢痕的形成。

圖3 FK866對缺血性腦卒中小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞活化的影響。A，GFAP表達水平免疫組織化學(xué)檢測與統(tǒng)計學(xué)分析；A1，GFAP表達的代表性免疫組織化學(xué)染色圖像；A2，GFAP表達的免疫組織化學(xué)染色強度的統(tǒng)計學(xué)分析。B，phosphacan和GFAP表達的免疫印跡法檢測與統(tǒng)計學(xué)分析；B1，phosphacan和GFAP表達的代表性免疫印跡檢測結(jié)果；B2，phosphacan和GFAP表達水平的統(tǒng)計學(xué)分析。*P<0.05，**P<0.01；n=4Fig. 3 Effect of FK866 on the activation of astrocytes in the brains of ischemic stroke mice. A, immunohistochemical detection and statistical analysis of GFAP expression. A1, representative images of GFAP immunohistochemical staining; A2, statistical analysis of the immunohistochemical staining intensity of GFAP expression. B, Western blot detection and statistical analysis of the expression of phosphacan and GFAP; B1, representative Western blot results of phosphacan and GFAP expression; B2, statistical analysis of the expression of phosphacan and GFAP. *P<0.05, **P<0.01; n=4

5 FK866抑制缺血性腦卒中后SARM1的表達

為了揭示FK866對腦缺血損傷后的神經(jīng)保護機制提供依據(jù)，應(yīng)用免疫印跡實驗檢測了FK866對腦缺血損傷后皮質(zhì)內(nèi)SARM1水平的影響。結(jié)果顯示：在缺血損傷后，Vehicle組小鼠皮層SARM1水平顯著上升；與Vehicle組相比，F(xiàn)K866組中SARM1水平顯著下降（圖4）。

圖4 SARM1表達的免疫印跡法檢測與統(tǒng)計學(xué)分析。A1，SARM1表達的代表性免疫印跡檢測結(jié)果；A2，SARM1表達水平的統(tǒng)計學(xué)分析；*P<0.05；n=4Fig. 4 Western blot detection and statistical analysis of the expression of SARM1. A1, representative Western blot results of SARM1 expression; A2, statistical analysis of the expression level of SARM1; *P<0.05; n=4

討論

近年來的研究顯示FK866在腦挫傷及腦缺血損傷的治療上具有神經(jīng)保護作用，通過降低煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT）的活性，阻礙煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）合成進而保護神經(jīng)元，減輕炎癥反應(yīng)，促進機體恢復(fù)[11,12]。然而FK866在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中還可以通過抑制SARM1的活性來發(fā)揮保護作用[8,13]。本研究探討了FK866在缺血性腦卒中后神經(jīng)保護作用的潛在機制，結(jié)果表明，F(xiàn)K866可能通過下調(diào)SARM1減輕缺血后神經(jīng)元的損傷，抑制膠質(zhì)細胞活化。

已有研究發(fā)現(xiàn)FK866減輕腦挫傷后誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷并改善神經(jīng)功能[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K866減少小鼠大腦皮層缺血灶面積和病灶內(nèi)凋亡神經(jīng)元的數(shù)量，減輕皮層缺血損傷程度。同時，F(xiàn)K866可以明顯改善缺血后小鼠的運動功能缺陷。研究顯示在光化學(xué)誘導(dǎo)缺血性腦卒中模型，自發(fā)性前肢活動與前爪抓握能力是評估神經(jīng)保護功能的良好指標(biāo)[14]，所以本研究應(yīng)用了圓筒試驗和網(wǎng)格爬行試驗，并發(fā)現(xiàn)FK866干預(yù)后的小鼠自發(fā)性使用損傷側(cè)前肢次數(shù)降低以及損傷對側(cè)前肢抓握能力增強，表明FK866在缺血性腦卒中后發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

本研究觀察到，大腦皮層缺血損傷發(fā)生后，F(xiàn)K866可以明顯抑制病灶部位小膠質(zhì)細胞的活化，這與在大鼠缺血再灌注模型中的研究結(jié)果類似[12]。FK866具有抗炎特性[7]，因此推測其對缺血后的神經(jīng)保護作用與抑炎反應(yīng)的誘導(dǎo)有關(guān)。小膠質(zhì)細胞在腦損傷后迅速被激活并做出反應(yīng)，目前已提出小膠質(zhì)細胞有兩種激活狀態(tài)，即具有促炎作用的M1型小膠質(zhì)細胞和具有抗炎作用的M2型小膠質(zhì)細胞[4]。本研究通過檢測缺血部位小膠質(zhì)細胞的極化情況，發(fā)現(xiàn)FK866干預(yù)后的小鼠皮層缺血部位iNOS蛋白水平降低而CD206蛋白水平升高，表明FK866促進病灶內(nèi)的小膠質(zhì)細胞向M2型極化。M2型小膠質(zhì)細胞可以清除細胞碎屑和死亡的神經(jīng)元，利于血腫清除、血管生成和組織重塑[15]，因此推測FK866是通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞向M2型極化，并發(fā)揮抗炎作用促進機體的恢復(fù)。

大腦缺血后的星形膠質(zhì)細胞功能受損，導(dǎo)致神經(jīng)元的進一步損傷甚至死亡，并且易聚集在病灶周圍形成膠質(zhì)瘢痕，阻礙神經(jīng)組織的修復(fù)[16]。本研究顯示FK866干預(yù)后的小鼠皮層缺血灶周圍星形膠質(zhì)細胞免疫反應(yīng)性降低，呈輕微的反應(yīng)性星形膠質(zhì)化。在大鼠局灶性腦缺血慢性期中觀察到FK866可以抑制星形膠質(zhì)細胞增生所致的膠質(zhì)瘢痕形成[12]，本研究結(jié)果也顯示FK866降低了病灶部位phosphacan的蛋白表達水平，抑制膠質(zhì)瘢痕的形成，這種抑制作用可能也參與受損神經(jīng)組織恢復(fù)的過程。表明FK866通過抑制缺血后膠質(zhì)細胞活化來緩解缺血性腦損傷的程度。

此外有研究指出FK866、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及SARM1之間存在明顯聯(lián)系[8,9]，因此推測其潛在機制可能是與SARM1的表達有關(guān)。在本研究中，F(xiàn)K866明顯下調(diào)缺血部位SARM1水平，然而相關(guān)研究多集中于化療、腦挫傷誘導(dǎo)的軸突變性中[11,17]，還未有在腦缺血損傷后探究FK866對 SARM1活性的調(diào)控，因此本研究是首次發(fā)現(xiàn)FK866抑制腦缺血損傷后誘導(dǎo)的SARM1水平上調(diào)。據(jù)報道，SARM1在受到損傷刺激后會誘導(dǎo)瓦勒變性、神經(jīng)元凋亡及促炎因子的產(chǎn)生[18,19]。因此FK866可能通過抑制SARM1的活性來減輕缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。SARM1是Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）下游的接頭蛋白之一，在星形膠質(zhì)細胞中TLRs可以通過SARM1信號途徑介導(dǎo)反應(yīng)性星形膠質(zhì)化來調(diào)控腦卒中后的炎癥反應(yīng)、神經(jīng)功能損傷和病灶梗死程度[20]。另一方面，體外實驗中證明SARM1上游的TLR4參與受損后小膠質(zhì)細胞引起的促炎反應(yīng)和先天免疫反應(yīng)[21]。

本研究表明腦損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化與SARM1密切相關(guān)。FK866可能通過調(diào)控SARM1上游因子TLRs參與的信號通路，進而降低小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)及膠質(zhì)瘢痕的形成，最終參與腦缺血損傷后的神經(jīng)修復(fù)。后期我們將進一步探究FK866在腦缺血后發(fā)揮保護作用的具體機制，為今后治療缺血性腦卒中提供有效藥物靶點，為臨床上缺血性腦卒中的治療提供新策略。