曲洪瑋，盧凱，黃珊珊，朱遂強(qiáng)

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430030）

腦出血（intracerebral hemorrhage, ICH）占全世界所有中風(fēng)的10%～15%，是一種極具破壞性的腦卒中亞型，具有高死亡率和發(fā)病率[1]。在初始損傷后，ICH繼發(fā)性腦損傷導(dǎo)致預(yù)后較差，目前尚無有效的治療方法[2]，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。鐵死亡（ferroptosis）是一種由鐵依賴脂質(zhì)過氧化物堆積引起的新的程序性細(xì)胞死亡形式[3]。鐵死亡廣泛參與各種神經(jīng)病理進(jìn)程，與神經(jīng)退行性疾病、癲癇、腦卒中、腦外傷等密切相關(guān)[4]。已有研究表明在老年小鼠ICH后出現(xiàn)細(xì)胞鐵死亡[5]，然而其具體的發(fā)病機(jī)制至今未明。

趨化性細(xì)胞因子受體5（C-C chemokine receptor 5, CCR5）是一種7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，在炎癥反應(yīng)初期參與募集白細(xì)胞進(jìn)入組織損傷區(qū)域，是進(jìn)行炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，并已被證明是抗炎治療的一個可行靶點(diǎn)[6]。FDA批準(zhǔn)的用于HIV患者的選擇性CCR5拮抗劑——馬拉維若（maraviroc, MVC）可改善免疫介導(dǎo)的急性和慢性組織炎癥動物模型的結(jié)局[7]。最近的研究表明，抑制CCR5可促進(jìn)小鼠創(chuàng)傷性腦損傷及腦缺血后小鼠運(yùn)動功能的早期恢復(fù)[8]。另一方面，應(yīng)用CCR5及拮抗劑的多項研究表明炎癥緩解并不是CCR5抑制的唯一結(jié)果。尤其在對CCR5免疫反應(yīng)與HIV感染、卒中和阿爾茨海默?。ˋD）相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，CCR5還參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)相關(guān)細(xì)胞信號傳導(dǎo)和神經(jīng)元可塑性介導(dǎo)多種形式的學(xué)習(xí)和記憶改變[8]。因此，CCR5極可能通過延伸的分子間相互作用同時促進(jìn)炎癥及非炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)而加劇疾病進(jìn)程。CCR5是否參與ICH后細(xì)胞鐵死亡病理進(jìn)程，目前未見報道。

鐵死亡是用來描述小分子清除素抑制胱氨酸的輸入，導(dǎo)致谷胱甘肽消耗和磷脂過氧化物酶谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）失活引起的細(xì)胞死亡形式[3,9]；在出血性腦卒中中，減輕鐵死亡可以通過抑制脂質(zhì)過氧化作用從而減少神經(jīng)功能損傷[10]。谷胱甘肽過氧化物酶4將潛在有毒的脂質(zhì)氫過氧化物（L-OOH）轉(zhuǎn)化為無毒的脂質(zhì)醇（L-OH）[11]，因此谷胱甘肽過氧化物酶4可以作為衡量鐵死亡程度的指標(biāo)。本研究利用CCR5基因敲除（CCR5-/-小鼠， 分析CCR5對小鼠ICH后細(xì)胞鐵死亡的影響。

材料與方法

1 材料

CCR5-/-雄性C57BL/6小鼠從江蘇集萃公司購入，經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院動物實(shí)驗中心（SPF級）凈化后，與野生型（WT）C57BL/6小鼠繁育子代得到CCR5+/-F1子代。F1代CCR5+/-基因型雌雄合籠繁育得F2代，經(jīng)基因鑒定篩選出CCR5+/+和CCR5-/-小鼠分別作為對照組和實(shí)驗組。實(shí)驗選用7～9周齡、24～26 g雄性小鼠，分為4組：野生型生理鹽水組（WT-Saline）、野生型腦出血組（WTICH）、基因敲除生理鹽水組（CCR5-/-- Saline）、基因敲除腦出血組（CCR5-/--ICH），每組3只。所有實(shí)驗操作均遵守華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院動物實(shí)驗中心動物倫理要求并按照實(shí)驗動物使用原則進(jìn)行。

2 ICH模型建立

用2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，用小鼠立體定位器固定小鼠使小鼠頭顱呈水平。將0.1 U的VII型膠原酶溶液（Sigma-Aldrich）融在在0.5 μL無菌生理鹽水中配成工作液。0.5 mm直徑孔鉆頭骨，用微量注射器將0.5 μL工作液以0.1 μL/min的速度慢慢注入到紋狀體中（立體定向坐標(biāo)為：前囟+0.20 mm，右旁開2.30 mm，深-3.50 mm[12]）。注射完畢后留針5 min。對照組與ICH組手術(shù)操作方式一致，微量注入不含膠原酶的無菌生理鹽水。

3 取材及切片

于造模后72 h，麻醉IHC模型鼠后經(jīng)心灌注 0.9%生理鹽水（25～50 mL）至右心耳流出液體清亮。斷頭取腦后輕輕剝除顱骨，于4%多聚甲醛固定液中4°C固定12 h。將鼠腦依次轉(zhuǎn)至25～50 mL含10%和30%蔗糖的0.1 mol/L PBS中，分別脫水直至組織沉底，0.01 mol/L PBS清洗后用OCT膠包裹固定在冰凍切片機(jī)凍頭上，冠狀切片，切片厚度20 μm，每個腦共切150張切片。切片裱于防脫落載玻片上，空氣干燥后冰箱內(nèi)保存。

4 HE染色

將小鼠腦冰凍切片室溫復(fù)溫后，加入4%多聚甲醛溶液再固定10 min，PBS漂洗3次，每次5 min，蒸餾水略洗后置于蘇木素溶液中染色3 min，流水沖洗余色； 0.7%鹽酸乙醇中分化10 s，流水緩慢沖洗，95%乙醇中浸泡10 s后在伊紅染液中染色1 min，流水緩慢沖洗余色；先后于75%、95%、100%（I）、100%（II）乙醇中各脫水10 s，二甲苯I和二甲苯II 中各透明10 s后中性樹膠封片。

5 免疫熒光染色

小鼠腦冰凍切片在染色缸充分復(fù)溫，加預(yù)冷4%多聚甲醛后固定20 min；0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次6 min。輕柔吸去多余液體, 免疫組織化學(xué)筆沿切片邊緣勾畫輪廓，滴加破膜液10 μL，覆蓋整個切片，室溫孵育15 min；0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次6 min，輕柔吸去周圍多余液體，滴加封閉液10 μL，室溫孵育1 h；封閉結(jié)束后0.01 mol/L PBS 漂洗2次，每次5 min。吸去周圍多余液體，滴加兔抗小鼠GPX4 抗體（1∶200）覆蓋整個切片，4 ℃濕盒孵育16 h；0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次7 min。吸去周圍多余液體，滴加Alexa 488標(biāo)記的驢抗兔IgG（1∶200），室溫避光孵育1 h；0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次6 min。DAPI染色液室溫避光孵育15 min后0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次7 min。避光條件下滴加50%甘油封片后，通過共聚焦顯微鏡觀察和拍攝圖像，每張腦片采集出血區(qū)域（基底節(jié)）部位腦片做后續(xù)統(tǒng)計分析。

6 Western blotting

取造模后72 h的出血區(qū)周邊 3 mm 范圍的腦組織，對照組取基底節(jié)部位組織，稱重后放入預(yù)冷的容器中，每0.05 g組織加入500 μL RIPA裂解液及10 μL Cocktail蛋白酶抑制劑，于冰上充分研磨10 min后冰上裂解30 min；勻漿移入 1.5 mL離心管中，超聲破碎2次，每次3～5 s（2次之間間隔10 min），后在4 ℃環(huán)境下以12000 r/min離心15 min；離心后取上清，BCA法測量蛋白濃度，按每孔50 μg蛋白加樣，12% SDS PAGE電泳，4 ℃恒流轉(zhuǎn)膜90 min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將NC膜小心置于脫脂奶粉封閉液中室溫下于搖床上孵育1 h；封閉結(jié)束后，用TBST將膜漂洗2次，每次5 min；兔抗GPX4 （1∶1000）、兔抗GAPDH（1∶10000）一抗4 ℃搖床上孵育16 h；一抗孵育結(jié)束后，用TBST將膜漂洗3次，每次5min， HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:10000）室溫孵育1 h；二抗孵育結(jié)束后，用TBST將膜漂洗3次，每次5 min；超敏ECL孵育顯影，博鷺騰GelView 6000 Pro化學(xué)發(fā)光式分析儀成像， Image Lab軟件分析結(jié)果，以GPX4 與GAPDH條帶光密度比值代表GPX4相對水平。

7 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實(shí)驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗；多于倆組數(shù)據(jù)的均數(shù)的兩兩比較用單因素方差分析事后LSD檢驗。P<0.05 則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 ICH后腦組織出現(xiàn)細(xì)胞鐵死亡

在WT小鼠腦內(nèi)注射膠原酶后，肉眼觀察即可見腦內(nèi)典型的血腫（圖1A）；腦片HE染色可見右側(cè)基底節(jié)區(qū)出現(xiàn)較大片染色丟失區(qū)域（圖1B）。免疫熒光染色顯示，在注射膠原酶的WT小鼠（WTICH組）腦出血區(qū)周圍腦區(qū)，GPX4免疫反應(yīng)性明顯減弱，與注射生理鹽水（WT-Saline組）相比，ICH模型小鼠GPX4陽性細(xì)胞明顯減少，反應(yīng)強(qiáng)度明顯減弱（圖2）。Western blot分析顯示，與注射生理鹽水（WT-Saline組）相比，在注射膠原酶的WT小鼠（WT-ICH組）腦出血區(qū)周圍腦區(qū)，GPX4蛋白表達(dá)量明顯減少（圖3）。以上結(jié)果表明ICH后可出現(xiàn)細(xì)胞鐵死亡。

圖1 小鼠ICH對腦組織內(nèi)GPX4免疫反應(yīng)性的影響。A，WT-ICH組小鼠腦內(nèi)血腫肉眼觀； B，WT-ICH組小鼠腦切片HE染色結(jié)果；C，WT-Saline組小鼠腦切片GPX4免疫熒光染色（DAPI復(fù)染）；D，WT-ICH組小鼠腦切片GPX4免疫熒光染色（DAPI復(fù)染）；綠色，GPX4免疫熒光染色；藍(lán)色，DAPI染色；比例尺，50 μm Fig. 1 Effect of ICH on GPX4 immunoreactivity in mouse brain. A, macroscopic observation of intracerebral hematoma in WT-ICH group; B, HE staining results of brain sections of mice in WT-ICH group; C. GPX4 immunofluorescence staining of the brain section in WT-Saline group (DAPI counterstaining); D, GPX4 immunofluorescence staining of the brain section in WT-ICH group (DAPI counterstaining); green, GPX4-immunofluorescence staining; blue, DAPI staining; scale bar, 50 μm

2 CCR5敲除減輕ICH后細(xì)胞鐵死亡

為了明確CCR5在ICH后腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡中的作用，繼而檢測了敲除CCR5對ICH后細(xì)胞鐵死亡的影響。免疫熒光染色顯示，相對于WT-ICH組， CCR5-/--ICH組GPX4陽性細(xì)胞數(shù)和GPX4免疫熒光強(qiáng)度的降低被抑制（圖2）；Western blot分析顯示，相對于WT-ICH組， CCR5-/--ICH組GPX4水平明顯增高（圖3）。由此表明，敲除CCR5可減少ICH損傷時腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡。

圖2 CCR5敲除對ICH小鼠腦內(nèi)GPX4表達(dá)影響的免疫熒光檢測。 A，WT-Saline組（A1）、WT- ICH組（A2）、CCR5-/--Saline 組（A3）和CCR5-/--ICH組（A4）腦組織GPX4表達(dá)的代表性免疫熒光染色結(jié)果（綠色，GPX4 ；藍(lán)色，細(xì)胞核DAPI復(fù)染）；比例尺，50 μm。B，GPX4陽性細(xì)胞數(shù)（B1）和GPX4免疫熒光強(qiáng)度（B2）統(tǒng)計學(xué)分析；***P＜0.001；**0.001＜P＜0.01；*0.01＜P＜0.05；n=3Fig. 2 Immunofluorescence detection of the effect of CCR5 knockout on the expression of GPX4 in the brain of ICH mice. A, representative immunofluorescence staining results of GPX4 expression in the brain tissues of WT-Saline group (A1), WT-ICH group (A2), CCR5-/--Saline group (A3) and CCR5-/--ICH group (A4) (green, GPX4; blue, nuclear DAPI counterstaining); scale bar, 50 μm。 B, statistical analysis of the number of GPX4 positive cells (B1) and the intensity of GPx4 immunofluorescence (B2); ***P<0.001; **0.001

圖3 CCR5敲除對ICH小鼠腦內(nèi)GPX4表達(dá)影響的Western blot檢測。 A，WT-Saline組、WT- ICH組、CCR5-/--Saline組和CCR5-/--ICH組腦組織GPX4水平的代表性Western blot檢測結(jié)果。B，GPX4陽性細(xì)胞數(shù)（左）和GPX4免疫熒光強(qiáng)度（右）統(tǒng)計學(xué)分析；***P＜0.001；**0.001＜P＜0.01；*0.01＜P＜0.05；n=3Fig. 2 Immunofluorescence detection of the effect of CCR5 knockout on the expression of GPX4 in the brain of ICH mice. A, representative GPX4 immunofluorescence staining results of brain tissues in WT-Saline group (a), WT-ICH group (b), CCR5-/--Saline group (c) and CCR5-/--ICH group (d) (green, GPX4; blue, nuclear DAPI counterstaining); scale bar, 50 μm。 B, statistical analysis of the number of GPX4 positive cells (left) and the intensity of GPx4 immunofluorescence (right); ***P<0.001; **0.001

討論

鐵死亡是一種鐵依賴形式的非凋亡性細(xì)胞死亡。形態(tài)學(xué)上，鐵死亡主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜斷裂和出泡，線粒體萎縮、膜密度增加、線粒體嵴減少甚至消失，但細(xì)胞核形態(tài)正常，無核濃縮或染色質(zhì)凝集現(xiàn)象。生物化學(xué)上，鐵死亡最重要特征為細(xì)胞內(nèi)大量鐵離子聚集、活性氧（reactive oxygen species, ROS）過度產(chǎn)生、谷胱甘肽（glutathione, GSH）耗竭等[3]。細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)膜被破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在體和體外實(shí)驗均證明，ICH模型中抑制鐵死亡可獲益[13]。GPX4 是一種內(nèi)源性抗氧化酶，它能完成脂質(zhì)過氧化物向無毒脂質(zhì)的轉(zhuǎn)化，并能抵抗脂質(zhì)過氧化[14]，且GPX4表達(dá)減少可引起細(xì)胞鐵死亡和脂質(zhì)活性氧積累[15]從而發(fā)生細(xì)胞鐵死亡。在本實(shí)驗中我們運(yùn)用VII型膠原酶構(gòu)建ICH模型后GPX4表達(dá)明顯減少，再次證實(shí)ICH后可出現(xiàn)細(xì)胞鐵死亡病理過程。

CCR5作為關(guān)鍵的炎癥受體，與趨化因子配體 CCL5等相互作用后調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫，在各種炎癥疾病中發(fā)揮作用[16]。CCR5還在癌癥發(fā)展和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[17]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，CCR5被證實(shí)參與腦梗死、ICH，多發(fā)性硬化，帕金森病和拉斯穆森腦炎等的病理進(jìn)程[7,18]。最近的研究更確立AD相關(guān)的CCR5與神經(jīng)元可塑性之間的關(guān)聯(lián)[7]。尤其值得關(guān)注的是，美國食品和藥物管理局 (FDA) 批準(zhǔn)的唯一第一代CCR5拮抗劑MVC耐受性良好，對抗HIV病毒顯示確定療效且具有治療其他疾病的潛能[7]。長期以來，大量神經(jīng)疾病研究因未能產(chǎn)生有效的臨床轉(zhuǎn)化而停滯不前。因此，如能確立某疾病與CCR5相關(guān)，則進(jìn)行預(yù)期有效的臨床治療將有巨大前景。NADPH氧化酶（Nox）是脈管炎ROS的主要來源, CCR5的配體CCL5可以濃度和時間依賴性方式誘導(dǎo)Nox1表達(dá)，致使ROS產(chǎn)生，誘導(dǎo)血管細(xì)胞遷移、增殖和炎癥標(biāo)志物增加；MVC預(yù)處理可減弱CCL5/CCR5誘導(dǎo)的Nox1表達(dá)[19]。鑒于ROS是細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵生物化學(xué)表征，CCR5很可能是同時關(guān)聯(lián)炎癥反應(yīng)與鐵死亡的細(xì)胞因子之一。這一猜想在本研究利用CCR5基因敲除小鼠進(jìn)行的腦出血研究中得到初步驗證：CCR5基因敲除可減少腦出血周邊細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生， CCR5可能參與腦出血后細(xì)胞鐵死亡的病理進(jìn)程。但是CCR5通過何種分子機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡仍需要進(jìn)一步研究。