張盛

(湖北省腫瘤醫(yī)院病理科，武漢 430079)

病理術中快速冰凍診斷可以確定術中切除標本的良惡性、判斷腫瘤的轉移情況、確定手術切緣或鄰近組織器官是否有腫瘤浸潤或殘留等，可以幫助臨床醫(yī)生在手術過程中盡快決定下一步手術方案，目前已成為病理科的一項重要工作。高質量且快速的術中快速冰凍診斷能縮短患者術中麻醉時間和臨床醫(yī)生的等待時間。優(yōu)化冰凍切片流程，提高冰凍切片質量，可大大減少漏診和誤診。眾所周知，冰晶形成是影響冰凍切片質量的重要因素之一。對于組織樣本周圍的水溶液，可在冷凍前，采用濾紙吸干的方法。而對于細胞內的水分需要在冰凍切片的制片過程中，盡量加快組織冷凍速度，從而使冰晶對組織的影響程度降到最低[1,2]。為加快組織冷凍速度，傳統(tǒng)方法是將組織放置于提前預冷的樣品托，加入包埋劑后冷凍，但存在切片時組織剝離的風險。本文通過預先在組織樣品托上加入少量包埋劑，制作出一層厚約 0.1 cm的“冰墊”，后將術中新鮮組織標本放置于帶有“冰墊”的樣品托上，包埋冷凍后切片。該方法既可大大縮短冰凍制片時間，又明顯改善冰凍切片中的出現(xiàn)的冰晶現(xiàn)象，提高冰凍切片的質量，現(xiàn)介紹如下。

材料與方法

1 材料

選取湖北省腫瘤醫(yī)院病理科術中快速室2021年4—5月份術中送檢新鮮標本（包括甲狀腺、乳腺和肺各20例）。

2 主要設備與試劑

設備：冰凍切片機（NX70，Thermo），組織染色機（HRS-18C，漢谷醫(yī)療）；試劑：普通液體合成膠水（宜興市申達文具有限公司），乙醇-甲醛-乙酸（AFA）固定液，無水乙醇、二甲苯（國藥試劑），1%鹽酸酒精分化液，飽和碳酸鋰返藍液，蘇木素、伊紅（貝索生物）等， BRAF V600E、HER-2和Ki-67一抗均購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

3 方法

首先，制作帶有“冰墊”的樣本托：在組織樣本托頭上加入約 1～2 mL的膠水，置于冰凍切片機內，5 s后輕輕放置冰錘于膠水上，待膠水凝固后挪走冰錘，便制成帶有“冰墊”的托頭，放置于冰凍切片機的箱體內備用。接著，將術中送檢新鮮手術標本隨機分為 2組，分別采用無“冰墊”法和有“冰墊”法兩種不方法冷凍包埋。無“冰墊”法：將組織放置于樣本托上，加適量膠水包埋后放入冰凍切片機速凍臺上進行速凍；有“冰墊”法：從冰凍切片機中取出預先制備好的帶“冰墊”托頭，將組織放置“冰墊”上，加適量的膠水后放入冰凍切片機速凍臺上進行速凍。最后，兩組組織樣本均按照常規(guī)進行切片、固定、HE染色、封片和鏡檢。

4 對比指標

切片時間：兩組均從組織放置冰凍切片機的速凍臺上開始計時，待切片HE染色封片完成后計時結束。

切片質量：由病理技師對60例冰凍切片的染色結果進行盲法評片。本實驗主要觀察切片有無裂隙、胞內外冰晶形成情況以及組織結構清晰度3項重要指標。具體評分標準如下：①若整張切片幾乎無裂隙、無冰晶形成、組織結構清晰，則各項均得10分；②若切片中見少量裂隙、少量冰晶形成，組織結構尚清晰且不影響觀察判斷，則各項得分減1～2 分；③若切片中見較多裂隙、大量冰晶形成，組織結構不清晰并且一定程度上影響觀察，則各項得分減 3～6 分；④若切片中見大量裂隙、大量冰晶形成，組織結構模糊不清并且嚴重影響診斷，則各項得分減 7～10 分。最終取兩位技術人員評分的平均值作為每張切片的最終得分。3項指標中每一項指標的得分都大于7.5分為切片質量佳，其余情況為切片質量不佳。3項指標均大于或等于9分為優(yōu)，均大于或等于8分為良，均小于6分為不合格，其余為基本合格。

免疫組織化學染色：同一新鮮組織標本對剖后分別采用有“冰墊”和無“冰墊”法進行冰凍切片后，均按照相同程序及時固定、常規(guī)脫水包埋、切片后進行免疫組織化學染色。具體步驟如下：組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精水化后，修復液中100 ℃煮沸2 min，自然冷卻至室溫。內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min后滴加即用型一抗，室溫下孵育60 min。PBS沖洗后滴加酶標二抗，室溫孵育15 min。PBS洗滌后滴加顯色液（DAB），顯色3～10 min，顯微鏡下觀察掌握染色時間，陽性染色為棕黃/褐色。蘇木素復染15～30 s，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均值±標準差表示，采用配對樣本非參數(shù)檢驗比較兩組切片時間和切片質量間有無差異。計數(shù)資料則采用卡方分析比較兩組切片優(yōu)良率間有無差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 有“冰墊”法冰凍切片時間較短

無“冰墊”組的切片時間為410.17±18.55 s，而有“冰墊”組的切片時間為328.57±13.34 s。與無“冰墊”組相比，有“冰墊”組的切片時間大大縮短（表1）。

表1 兩種冰凍方法切片時間比較Tab.1 Comparison of section time between two methods

2 有“冰墊”法冰凍切片優(yōu)良率較高

對比觀察兩組冰凍切片的染色情況可見，大部分無“冰墊”法的組織切片中形成冰晶，出現(xiàn)少量不規(guī)則腔隙，細胞核被擠壓，組織結構稍變形，而有“冰墊”法切片中極少形成冰晶，組織結構完整（圖1）。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，有“冰墊”法組織有無裂隙、冰晶形成情況、組織結構清晰度3項指標得分均高于無“冰墊”法（表2）。此外，有“冰墊”法的切片染色優(yōu)良率為 88.33%（53/60）也明顯高于無“冰墊”法的 55.00%（33/60，P= 0.007）（表3）。

表2 兩種方法切片質量評分比較Tab.2 Comparison of section quality scores between two methods

3 兩種方法免疫組織化學染色效果無差異

對比兩種方法制備切片的免疫組織化學染色效果顯示：甲狀腺組織中的BRAF V600E、乳腺組織中的HER-2和肺組織中的Ki-67等抗原的免疫組織化學染色強度和定位在兩種方法之間均無明顯差異（圖2）。

討論

冰凍切片技術目前已成為病理科的一項常規(guī)工作，在病理診斷工作中發(fā)揮著不可忽視的作用[3]。其原理是利用物理降溫的方法，在-25℃的低溫條件下，短時間內將組織冷凍成硬塊后進行切片的一種常規(guī)技術方法[4]。冰凍切片可對手術過程中送檢的組織做出精準的診斷，為臨床手術醫(yī)師術中手術方案的制定提供重要的判斷依據(jù)。日常工作中都是要求術中冰凍報告在30 min之內發(fā)出。因此，在保證切片質量的前提下，盡量縮短切片時間，可減少術中患者的麻醉時間和臨床醫(yī)生的術中等待時間，具有重要的臨床價值。本實驗通過比較發(fā)現(xiàn)，與普通冷凍法相比，使用“冰墊”進行包埋切片，可大大縮短冰凍制片時間，具有重要的臨床意義。

眾所周知，減少冰晶形成是冰凍切片質量控制中的關鍵環(huán)節(jié)。組織冷凍速度緩慢，耗時長，就容易產(chǎn)生細胞內外的冰晶，出現(xiàn)組織細胞的空核、間質疏松等假象，嚴重者可以導致細胞和組織結構形態(tài)變化，進而不利于術中病理診斷[5,6]。前期有研究表明，采用梯度蔗糖溶液預處理組織后冷凍可有效減少冰晶的形成[7]，但其應用于腦組織時效果并不理想[8]，并且使用蔗糖脫水法耗時較長，無法滿足術中快速的時間需求。由此可見，快速冷凍是減少冰凍切片中冰晶形成的主要解決辦法。本實驗通過比較發(fā)現(xiàn)，與普通冷凍法相比，使用“冰墊”可起到速凍的效果，從而有效減少冰晶的產(chǎn)生，且大大提高了制片質量。同時，與無“冰墊”組相比，采用“冰墊”進行冰凍切片不影響免疫組化指標的表達情況。然而，使用冰凍剩余組織進行免疫組化檢測時，前期的低溫冷凍處理是否對各項指標的特異性和敏感性產(chǎn)生影響，還有待進一步地研究。

除此之外，使用“冰墊”進行包埋時還具有以下優(yōu)點：首先，在術中快速冰凍制片過程中，將新鮮組織放置在帶有“冰墊”的樣品托上，再滴加膠水，由于“冰墊”的粘附作用，使得包埋劑不容易外溢，更利于樣品托牢牢卡在冰凍切片機的樣品頭上。其次，對于術中送檢的微小組織，例如支氣管切緣、脈管切緣和細小淋巴結等，將微小組織放置在“冰墊”上再滴加膠水，可有效防止組織冷凍過程中下沉到樣品托的底部，從而使切片時樣本托和刀座間保持有足夠的距離，防止損傷切片機和減輕技術員切片時的心理壓力。另外，對于臨床送檢皮膚切緣或囊性組織，通常要求立埋，使用冰墊可以防止組織在冷凍過程中的傾斜，從而達到立埋的效果。

在制作“冰墊”的過程中應注意：首先，樣品托需要在常溫下滴加膠水，再放置于冰凍切片機中，使用冰錘制作“冰墊”，不建議在預冷的樣品托上滴加膠水制作“冰墊”，因為后者容易導致切片過程中出現(xiàn)組織脫落的風險，我們推測可能和空氣熱脹冷縮的原理有關系。其次，在制作“冰墊”時，樣本托上滴加的膠水不易過多，防止膠水外溢而不利于樣本托固定在冰凍切片機的樣本頭上。

總之，術中冰凍制片過程中，由于冷凍過慢等原因造成冰晶形成及組織裂隙的產(chǎn)生嚴重影響冰凍切片的質量及術中快速診斷的準確性。本研究發(fā)現(xiàn)使用“冰墊”能大大縮短冰凍制片時間，有效減少冰晶的形成，并提高冰凍制片的質量。該方法操作簡便且不需要特殊設備，值得在日常的冰凍制片過程中推廣使用。