王艷樹，賀海云，斯琴朝克圖，，4，5*，劉陽，姜益泉，戴余軍，4，李長春，陶鑄，4，5，章愛群，5

（1.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；2.孝感市公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北 孝感 432000；3.鐘祥市正禾農(nóng)牧有限公司，湖北 鐘祥 431900；4.湖北工程學(xué)院湖北省植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖北 孝感 432000；5.湖北工程學(xué)院生態(tài)毒理與食品安全研究中心，湖北 孝感 432000）

硒是人和動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗炎、防止心腦血管疾病等廣泛的生物學(xué)功能，并且可以通過產(chǎn)生活性甲狀腺激素有效預(yù)防輕度浸潤性突眼?。╣raves' ophthalmopathy，GO）的惡化、發(fā)揮抗艾滋病等作用[1-5]。硒元素還具有拮抗重金屬毒性、延緩衰老、提高生殖機(jī)能的作用。在人體內(nèi)硒元素主要以硒蛋白的形式發(fā)揮生理學(xué)功能，包括谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶和甲狀腺激素脫碘酶等[6]。研究表明，人體吸收硒元素的主要形式為有機(jī)硒，少量是以無機(jī)硒的形式吸收[7]。根據(jù)中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)發(fā)布的《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量（2013版）》，成人硒元素推薦攝入量為60 μg/d，平均需要量為50 μg/d[8]，而中國居民日常飲食中硒攝入量平均值為43.3 μg/d，部分區(qū)域居民攝入量嚴(yán)重低于中國居民平均需要量標(biāo)準(zhǔn)[9]。

茶葉為中國最普遍的飲料，含有多種與人體健康密切相關(guān)的有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)元素。茶葉中對人體健康有益的無機(jī)元素包括鈣、鎂、鋅、鐵、銅、錳、硒等。茶樹可通過生物富集和轉(zhuǎn)化作用，把非生物活性和毒性較高的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為安全有效、毒性低的有機(jī)硒[10-12]。據(jù)報(bào)道，茶水中浸出的硒絕大部分是有機(jī)硒[13]，因此通過飲茶的方式補(bǔ)充硒元素是一種有效的補(bǔ)硒途徑。而現(xiàn)有含硒茶葉的相關(guān)研究大部分集中在茶葉產(chǎn)地、種植方式與硒含量的關(guān)系、茶葉對土壤或肥料中的硒元素吸收方式和程度等，而缺乏茶葉浸泡時(shí)間、飲茶日常習(xí)慣對硒溶出和攝入量影響的相關(guān)研究。人們通常飲用的是茶湯而少見直接食用茶葉，因此浸泡時(shí)間、飲茶習(xí)慣和茶葉處理方式直接影響硒元素的溶出度，而茶湯中硒元素的濃度進(jìn)一步影響人體對硒元素的攝入程度。據(jù)此，本文以3種不同種類茶葉（紅茶、青茶和綠茶）作為研究對象，建立一種可靠、穩(wěn)定、簡便的檢測茶葉中硒元素含量的方法，分別測定3類茶葉中硒元素含量，并進(jìn)一步模擬人們?nèi)粘ｏ嫴璺绞?，采用室溫?5±2）℃下沸水泡制茶葉的方法，揭示茶湯中硒元素溶出量隨浸泡時(shí)間的變化趨勢，為人們提供不同種類高含硒茶的正確飲用方式，并為富硒茶和高含硒茶葉的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青茶（烏龍茶）、紅茶：詔安市月之港茶業(yè)有限公司；綠茶（Ⅰ）：湖北宣恩維民實(shí)業(yè)有限公司；綠茶（Ⅱ）：市售恩施高山綠茶。

硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL）：國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；硝酸、鹽酸、氫氧化鉀（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硼氫化鉀（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；30%過氧化氫（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

硒標(biāo)準(zhǔn)使用液（1 μg/mL）：精密量取 1 000 μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL于100 mL容量瓶中，用10%鹽酸溶液定容至刻度，混勻，過濾，備用。

另配制10%鹽酸溶液、6 mol/L鹽酸溶液、0.5%氫氧化鉀+1.0%硼氫化鉀溶液（還原劑）等備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SK-2003氫化物原子熒光光譜儀：北京金索坤技術(shù)開發(fā)有限公司；MARS6微波消解儀：美國CEM儀器公司；HI-1000恒溫電熱板：亞速旺（上海）商貿(mào)有限公司；TG16G型低速臺(tái)式離心機(jī)：上海趙迪生物科技有限公司；FA1004N型電子天平：上海菁華科技儀器有限公司；XMTD-8222型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Direct-Q3超純水系統(tǒng)：美國密理博公司；JOYN-30AL型智能超聲波清洗機(jī)：上海喬躍電子有限公司。

1.3 茶葉和茶湯中硒含量測定的前處理方法

消解：將準(zhǔn)備好的青茶（烏龍茶）、紅茶、綠茶（Ⅰ）、綠茶（Ⅱ）的茶葉樣品進(jìn)行烘干、稱量、粉碎，過80目尼龍篩，分別裝袋，放置干燥器中，備用。分別稱取已粉碎好的茶葉樣品0.500 0 g（茶湯中硒含量檢測時(shí)，取浸泡后的茶湯10 mL。其后續(xù)處理與茶葉樣品相同），置于清洗干凈且干燥的聚四氟乙烯消解罐中，加硝酸10 mL，使樣品充分浸沒，輕輕振搖混合均勻，在室溫（25±2）℃下敞口靜置10 min，再加入1 mL過氧化氫，預(yù)消解30 min，放置于微波消解儀內(nèi)，按照設(shè)定程序（見表1）進(jìn)行消解。

表1 微波消解儀的設(shè)定參數(shù)Table 1 Parameters of microwave digestion

趕酸：消解完畢后冷卻至室溫（25±2）℃，將消解液轉(zhuǎn)入50 mL錐形燒瓶中，在電熱板上設(shè)定120℃，加熱趕酸至近干，取下冷卻，再加入6 mol/L鹽酸溶液5.0 mL，在90℃繼續(xù)加熱至溶液澄清、無色或略帶黃色的狀態(tài)，將溶液體積加熱至約1 mL，冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用10%鹽酸溶液定容，混勻，將定容好的樣品溶液用針筒式濾膜（孔徑0.45 μm）過濾器過濾，濾液裝于干凈的容量瓶中搖勻，待測。每個(gè)樣品平行處理3份，每份平行測定3次。

消解和趕酸時(shí)，以相應(yīng)質(zhì)量或體積的超純水作為茶葉和茶湯的空白對照。

1.4 茶葉中硒含量和茶湯中硒溶出率測定

茶葉中硒含量測定：茶葉按照1.3的樣品處理方法消解、趕酸、過濾，用SK-2003氫化物原子熒光光譜儀測定。

茶湯中硒溶出率測定：預(yù)先將實(shí)驗(yàn)室溫度調(diào)節(jié)為恒溫（25±2）℃，分別稱取紅茶、綠茶（Ⅰ）和青茶（烏龍茶）0.500 0 g各10份，分別加入沸騰純凈水50 mL，每組茶湯分別浸泡 0、5、10、15、20、40、60、120、180 min和300 min，過濾并記錄過濾時(shí)濾液的溫度。分別按照1.3的樣品處理方法消解、趕酸、過濾，用SK-2003氫化物原子熒光光譜儀，在最佳條件下測定茶湯中的硒元素含量。硒溶出率計(jì)算公式如下。

式中：C為茶湯中硒質(zhì)量濃度，μg/L；V為茶湯總體積，L；M為沖泡茶葉中所含硒質(zhì)量，μg（M=茶葉中硒質(zhì)量濃度×茶葉質(zhì)量）。

1.5 定量分析方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確量取硒標(biāo)準(zhǔn)使用液 0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mL，用10%鹽酸溶液分別定容至100 mL，混勻，使得硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度梯度為0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、15.00 μg/L。用氫化物原子熒光光譜儀在最佳工作條件下（以上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中的0 μg/L濃度溶液作為空白對照），由稀到濃依次測量標(biāo)準(zhǔn)系列溶液熒光值，以熒光值作為縱坐標(biāo)，濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 檢出限的確定

取1.5.1中標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中的0 μg/L濃度溶液，按照1.3的樣品制備方法處理，共測定硒含量11次。計(jì)算公式為檢出限=平均數(shù)+常數(shù)×標(biāo)準(zhǔn)偏差（所取指數(shù)為 3）。

1.5.3 準(zhǔn)確度與精密度的測定

向綠茶（Ⅱ）茶葉中加入適量硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，使茶葉中硒元素的低、中、高濃度分別為60、180 μg/kg和540 μg/kg；另向浸泡30 min并過濾后的綠茶（Ⅱ）茶湯中加入適量硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，使茶湯中的硒元素低、中、高濃度分別為0.3、0.9 μg/L和2.7 μg/L。采用1.3中的方法制備，用原子熒光光譜儀在最佳條件下分別檢測不同濃度硒元素加標(biāo)的茶葉和茶湯，回收率采用單點(diǎn)校正法計(jì)算。同一天內(nèi)每個(gè)質(zhì)量濃度測5個(gè)平行，計(jì)算日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，每種樣品重復(fù)5 d，計(jì)算日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。檢測時(shí)未加標(biāo)樣品作為空白對照，減除背景值，計(jì)算其回收率與精密度。計(jì)算公式為回收率/%=[加標(biāo)濃度（μg/kg或μg/L）-空白樣品濃度（μg/kg或μg/L）]/加標(biāo)濃度（μg/kg或μg/L）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器最佳工作條件的確定

參考儀器對硒元素測定的推薦值，通過加標(biāo)回收率試驗(yàn)優(yōu)化驗(yàn)證后確定。通過1.5中的準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)驗(yàn)證后確定的氫化物原子熒光光譜儀最佳參數(shù)為主泵轉(zhuǎn)速100 r/min、負(fù)高壓270 V、燈電流70 mA、爐高8mm、采樣延時(shí)10s、泵停延時(shí)10s、稀釋延時(shí)10s、載氣流量600 mL/min、輔氣流量800 mL/min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限的確定

在氫化物原子熒光光譜儀最佳條件下，對硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測定，每個(gè)試樣平行重復(fù)3次，取其平均值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，線性回歸方程為y=105.171x+5.667，線性相關(guān)系數(shù)＝0.999 1。在設(shè)定濃度0～15.00 μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系和相關(guān)性，符合本文定量分析要求。光學(xué)分析方法公式計(jì)算得到的茶湯和固體茶葉中檢出限分別為0.003 26 μg/L和0.006 50 μg/kg。

2.3 加標(biāo)回收率與精密度測定結(jié)果

為減少背景值數(shù)，降低儀器檢測靈敏度對加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)的干擾，選取硒含量較低的綠茶（Ⅱ）作為加標(biāo)回收率試驗(yàn)對象進(jìn)行檢測，其加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）結(jié)果見表2。

表2 茶葉和茶湯中硒元素加標(biāo)平均回收率（n=3）Table 2 Average recovery rate of selenium in tea and tea infusions（n=3）

由表2可知，茶葉和浸泡茶湯中硒加標(biāo)回收率分別在83.87%～87.37%和88.88%～115.56%之間，RSD在0.17%～5.67%，均可滿足定量分析方法學(xué)要求和實(shí)際測樣需求。

2.4 茶葉中硒元素含量分析

采用氫化物原子熒光光譜儀-微波消解方法，測定紅茶、綠茶（Ⅰ）和青茶（烏龍茶）中硒元素含量，平行3 次，結(jié)果分別為 104.27、179.93 μg/kg和 149.48 μg/kg，RSD分別為0.75%、0.45%和0.38%。根據(jù)NY/T 600-2002《富硒茶》[14]，富硒茶定義為富硒區(qū)土壤上生長的茶樹新梢的芽、葉、嫩莖，經(jīng)過加工制成，可供直接飲用，含硒量在 250 μg/kg～400 μg/kg內(nèi)的茶葉。本文選取的3種茶葉中硒元素含量相對較高，但均低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的富硒茶標(biāo)準(zhǔn)含量。

2.5 茶湯中硒元素動(dòng)態(tài)溶出特性

選擇含硒量較高的紅茶、青茶（烏龍茶）和綠茶（Ⅰ）3種茶葉作為研究材料，模擬人們平時(shí)喝茶習(xí)慣，采用沸水浸泡茶葉的方法，室溫（25±2）℃下分別浸泡5、10、15、20、40、60、120、180 min 和 300 min 后取樣檢測茶湯中溶出的硒元素含量，研究茶湯中硒元素含量隨浸泡時(shí)間的變化規(guī)律。室溫（25±2）℃下茶葉浸泡過程中茶湯溫度隨時(shí)間變化規(guī)律見圖1。

圖1 茶湯溫度隨時(shí)間的變化規(guī)律（n=3）Fig.1 Temperature changes of tea infusions（n=3）

茶葉和茶湯中硒元素含量和溶出率動(dòng)態(tài)變化規(guī)律結(jié)果見表3和圖2。

表3 紅茶、青茶和綠茶茶湯中硒溶出特性與浸泡時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律（n=3）Table 3 Selenium dissolution in infusions of black tea，oolong tea and green tea（n=3）

圖2 室溫下沸水浸泡茶葉中的硒元素溶出動(dòng)態(tài)規(guī)律（n=3）Fig.2 Dynamic law of selenium dissolution in tea infusions at room temperature（n=3）

由圖1可知，室溫（25±2）℃下茶湯溫度40 min內(nèi)從沸騰狀態(tài)急速下降到40℃，冷卻到30℃所需時(shí)間為60 min。之后直至300 min，茶湯溫度下降速度相對趨緩。

由表3和圖2可知，用沸水浸泡紅茶、青茶（烏龍茶）和綠茶（Ⅰ）茶葉后，浸泡時(shí)間在20 min～120 min時(shí)，3種茶葉中硒元素溶出量均有高峰值出現(xiàn)。浸泡5 min～20 min時(shí)，綠茶茶湯中的硒含量急劇升高，浸泡40min～180min時(shí)，硒含量相對穩(wěn)定，浸泡120 min時(shí)硒含量達(dá)到峰值，其硒質(zhì)量濃度為121.46 μg/kg。紅茶和青茶茶湯中硒溶出量達(dá)到峰值的時(shí)間分別為60 min和20 min，硒質(zhì)量濃度分別為 71.24 μg/kg 和 97.84 μg/kg，之后緩慢下降至10.09 μg/kg和 10.35 μg/kg。

紅茶、青茶（烏龍茶）和綠茶（Ⅰ）的硒元素最大溶出率分別達(dá)到68.31%、65.44%和67.51%。硒溶出量達(dá)到最高峰之后，綠茶（Ⅰ）與其它兩種茶的溶出特性有較為明顯的區(qū)別，硒含量下降趨勢更緩慢，浸泡到300 min時(shí)的綠茶（Ⅰ）茶湯中的硒質(zhì)量濃度為83.31 μg/kg（見表3），相應(yīng)的溶出率卻僅下降為46.31%。

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品前處理

微波消解-氫化物原子熒光光譜儀方法測定茶葉中的硒元素含量時(shí)，前處理方法的選擇對測定結(jié)果可靠性的影響較大。目前常用前處理方法，包括干法消解、濕法消解、微波消解等。其中濕法消解方法具有消化完全、元素?fù)p失少等優(yōu)點(diǎn)，但每次處理樣品量少，且消化過程中易產(chǎn)生爆沸，有一定的安全隱患。干法消解方法一次可處理大批量樣品，但存在茶葉消化處理不徹底的現(xiàn)象。而微波消解法結(jié)合了高壓消解和微波快速加熱兩方面的性能，能直接穿透樣品內(nèi)部，具有加熱速度快、均勻、無溫度梯度、無滯后效應(yīng)等特點(diǎn)。微波消解是在密閉條件下進(jìn)行，因此易揮發(fā)元素的損失相對較少、消解效率高、速度快、化學(xué)試劑用量少、交叉污染小，尤其適合難溶樣品和生物試樣，可從整體上提高樣品消解和測定的速度和質(zhì)量[15-17]?？紤]各種前處理方法的優(yōu)、缺點(diǎn)和實(shí)測對比后，本研究采用微波消解法處理茶葉樣品，進(jìn)行詳細(xì)的定量分析方法學(xué)研究。結(jié)果表明，固體茶葉和浸泡茶湯中硒元素加標(biāo)回收率分別在83.87%～87.37%和88.88%～115.56%之間，RSD在0.17%～5.67%范圍內(nèi)，符合定量分析方法學(xué)要求。GB 5009.93—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測定》[18]中的檢測限相關(guān)表述為當(dāng)樣品用量為1 g時(shí)，最低檢出濃度為0.001 mg/L。相較于上述國標(biāo)方法，本方法茶湯和茶葉中檢出限更低，分別為0.003 26 μg/L和0.006 50 μg/kg。但采用的前處理方法復(fù)雜，適合硒含量較低樣品的精密檢測。

3.2 茶湯中硒元素溶出規(guī)律

此前，關(guān)于茶葉中硒元素溶出率相關(guān)研究較少，有限的研究文獻(xiàn)也主要集中在優(yōu)化茶水比、浸泡溫度、浸泡時(shí)間和茶葉粒徑等單一因素對單一品牌茶葉在浸泡過程中硒溶出量的影響。如鄭宏彬等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)浸泡條件為浸泡溫度100℃、浸泡時(shí)間6 min、茶水比2∶50（g/mL）。在最優(yōu)浸泡條件下，硒的溶出量為385.57 ng/g，且一道茶湯中硒的浸出率約為12%，分別是二道茶湯和三道茶湯的3倍和6倍～7倍。黎梅雨等[20]研究了不同浸泡條件對紫陽富硒茶中硒溶出的影響。結(jié)果表明，當(dāng)浸泡溫度100℃、浸泡時(shí)間3 min、料液比為1∶100（g/mL）、浸泡次數(shù)為2次時(shí)紫陽富硒茶中的硒元素溶出較多。根據(jù)多數(shù)研究報(bào)道，最佳浸泡溫度均為100℃或沸水，浸泡時(shí)間3 min～6 min之間，茶水比 1∶25（g/mL）～1∶100（g/mL）。導(dǎo)致不同研究結(jié)果的原因主要在于茶葉產(chǎn)地或茶葉品種不同。上述研究設(shè)計(jì)中缺乏考慮人們平時(shí)飲茶習(xí)慣和自然飲用狀態(tài)下的硒元素溶出和攝入的綜合因素。本研究結(jié)果表明，沸水浸泡紅茶、青茶（烏龍茶）和綠茶（I）時(shí)，不同茶葉中的硒溶出率不同，其溶出率時(shí)間曲線也有著很大的差異。在室溫（25±2）℃下，當(dāng)茶水比為0.5∶100（g/mL）時(shí)，紅茶、青茶（烏龍茶）和綠茶（I）中硒溶出率峰分別出現(xiàn)在20、60 min和120 min，溶出率分別達(dá)到68.31%、65.44%和67.51%。達(dá)到高峰后隨著時(shí)間的推移和浸泡水溫的下降，硒元素在水中的溶出率也緩慢下降。3種茶葉的共同特點(diǎn)是浸泡前20 min內(nèi)硒元素溶出率急劇上升，達(dá)到高峰后綠茶中的硒溶出率比青茶和紅茶下降更緩慢。當(dāng)泡制時(shí)間達(dá)到300 min時(shí)，紅茶和青茶中的硒質(zhì)量濃度已下降到10.09 μg/kg和10.35 μg/kg，而綠茶中的硒質(zhì)量濃度僅下降到83.31 μg/kg。因此，用紅茶和青茶作為補(bǔ)硒飲品時(shí)浸泡時(shí)間不宜過長。茶湯中硒含量迅速下降的原因可能是紅茶和青茶的加工程序繁雜，茶葉中物質(zhì)成分較多，含有大量有機(jī)大分子物質(zhì)。在浸泡過程中隨著水溫的下降，已經(jīng)溶出的硒元素與茶湯中的大分子物質(zhì)結(jié)合，進(jìn)一步集聚生成顆粒物沉淀，在茶湯過濾時(shí)被去除。3種茶葉沸水浸泡的前期，茶湯中硒溶出率較高，其原因在于水溶性物質(zhì)在水溫較高時(shí)易于溶出。再結(jié)合本研究結(jié)果，可以總結(jié)為不同浸泡條件對不同種類茶葉中硒元素溶出率的影響不同。但紅茶和青茶后期硒溶出率下降比綠茶更明顯，因此在二道茶中的硒含量是否更高，還需進(jìn)一步比較研究。