孫慶慶， 陳曉泉， 陳潞君， 曲美霖， 李 京

1. 聯(lián)勤保障部隊臨潼康復(fù)療養(yǎng)中心，陜西 西安710600；2. 陜西省腫瘤醫(yī)院 中西醫(yī)科，陜西 西安710061；3. 中國醫(yī)科大學(xué)，遼寧 沈陽110122；4. 沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽110016；5. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽110032

肝癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。 目前，肝癌的治療措施主要包括手術(shù)、介入、靶向、免疫治療等，但均面臨有效率低、藥物耐藥、腫瘤復(fù)發(fā)等問題[1-3]。 近年來，中藥在治療肝癌方面發(fā)展迅速，在改善患者臨床癥狀、減輕痛苦、延長生存期方面發(fā)揮著重要作用[4-7]。 中華獼猴桃根在治療肝癌中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但其抗肝癌的作用機制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，臨床應(yīng)用受到限制。 因此，有必要深入研究其抗肝癌的分子作用機制。 本研究從中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接角度對中華獼猴桃根治療肝癌可能的靶點進行數(shù)據(jù)挖掘，旨在探討中華獼猴桃根對肝癌具體的分子作用機制。 現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 中華獼猴桃根的活性化學(xué)成分及靶點基因來自中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP，https:/ /tcmsp-e. com/)、SymMAP 數(shù)據(jù)庫、HERB 數(shù)據(jù)庫、pubchem 數(shù)據(jù)庫，以及相關(guān)文獻報道。 從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(the cancer genome atlas，TCGA)和國際癌癥基因組聯(lián)合體數(shù)據(jù)庫(International Cancer Genome Association Database，ICGC)下載截至2021 年12 月收錄的肝癌患者腫瘤組織與正常肝組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床信息。 代謝相關(guān)基因來自MSigDB 數(shù)據(jù)庫和Gene Cards 數(shù)據(jù)庫。

1.2 研究方法

1.2.1 中華獼猴桃根有效活性成分及靶點篩選 首先從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“Actinidia Chinensis Planch”，挖掘與中華獼猴桃根相關(guān)的活性成分，利用molsoft 網(wǎng)站和preADMET 網(wǎng)站對文獻中報道的相關(guān)活性成分進行DL 評分，篩選出類藥性DL≥0.18 的化合物為中華獼猴桃根的有效活性成分。 從SymMAP 數(shù)據(jù)庫、HERB 數(shù)據(jù)庫及pubchem 數(shù)據(jù)庫檢索出每個活性成分對應(yīng)的相關(guān)靶點。 利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫中下載的“homo sapiens”的所有基因數(shù)據(jù)，整理所得靶點蛋白和基因信息，進行標(biāo)準(zhǔn)化校正。

1.2.2 靶點基因的篩選 利用R 4.1.1 軟件，以P ＜0.05 及l(fā)ogFC ＞1 為篩選條件，獲得肝癌組織中差異表達的代謝基因。 將差異代謝基因與中華獼猴桃根活性成分的靶基因做交集處理，獲得交集基因，即中華獼猴桃根主要作用于肝癌代謝相關(guān)的基因靶點。

1.2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape 3.9.0軟件建立“中華獼猴桃根藥效成分-靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)，獲取節(jié)點的度值較大的靶點。 將中華獼猴桃根抗肝癌靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，利用“Multiple proteins”模塊工具進行“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”的相互作用分析，參數(shù)“organism”設(shè)置為“homo sapiens”，參數(shù)“minimum required interaction score”設(shè)置為“medium confidence(0.400)”，參數(shù)“network display options”設(shè)置為“hide disconnected nodes in the network”，其他參數(shù)設(shè)置均為系統(tǒng)默認(rèn)值。

1.2.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 對交集基因進行GO 功能富集分析，篩選條件為P ＜0.05，利用colorspace 包、stringi 包、DOSE 包、clusterProfiler 包、pathview 包等R 包繪制出基因涉及的生物學(xué)功能、途徑、細胞定位3 方面的生物過程。 KEGG 通路富集分析中華獼猴桃根治療肝癌過程中顯著改變的代謝通路，篩選條件為P ＜0.05，利用enrichplot 包、ggplot2 包、pathview 包分析KEGG 富集的關(guān)鍵通路。

1.2.5 分子對接 通過PDB 數(shù)據(jù)庫搜索蛋白靶點，利用vina 軟件進行分子對接， 結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol提示藥效分子與蛋白之間的結(jié)合活性較高。 應(yīng)用PyMOL 軟件對結(jié)合能絕對值較大的對接結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 藥效成分及差異代謝基因靶點篩選結(jié)果 TCMSP平臺最終篩選出15 種中華獼猴桃根有效成分化合物，涉及靶點基因326 個。 MSigDB 數(shù)據(jù)庫和Gene Cards 數(shù)據(jù)庫獲得1 095 個代謝相關(guān)基因，提取代謝基因在TCGA 數(shù)據(jù)庫肝癌表達譜中的表達量，將篩選后的321 個差異表達的代謝基因納入研究，并與326 個靶點基因進行交集映射，得到ACACA、ACSL4、AKR1C3、CYP1A2、CYP2C19 等表達上調(diào)或下調(diào)的20 個抗癌基因。

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將20 個靶點基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)中構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖1a)。 將互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape創(chuàng)建中華獼猴桃根的藥效成分與對應(yīng)靶點的網(wǎng)絡(luò)映射，主要涉及槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、芒柄花素、蘆薈大黃素、胡蘿卜素等13 種活性成分，對應(yīng)ACACA、 ACSL4、 AKR1C3、 CYP1A2、 CYP2C19、CYP2C9 等20 個潛在靶點(圖1b)。

圖1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果(a. 交集基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖；b. “中華獼猴桃根活性成分-靶點基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖)

圖2 GO 富集分析結(jié)果 圖3 KEGG 通路富集分析結(jié)果

2.3 GO 功能與KEGG 通路富集分析結(jié)果 GO 富集分析結(jié)果顯示，其生物學(xué)過程主要在脂肪酸代謝過程、長鏈脂肪酸代謝過程、不飽和脂肪酸代謝過程、烯烴化合物代謝過程、脂肪酸生物合成過程等。見圖2。 KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，信號通路主要涉及化學(xué)致癌作用-DNA 加合物、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、藥物代謝-細胞色素P450、細胞色素P450 對異生物質(zhì)的代謝等。 見圖3。

2.4 分子對接結(jié)果 藥物活性成分-靶點-潛在通 路分析結(jié)果顯示，共涉及9 個代謝途徑，POLD1、AKR1C3、CYP2C9、ACACA 等4 個靶點基因，槲皮素、山奈酚2 種有效成分。 見圖4。 對篩選得到的2 個有效成分與4 個靶點基因進行分子對接，結(jié)果顯示，槲皮素-POLD1 結(jié)合能為-9.7 kcal/mol，山奈酚-AKR1C3 結(jié)合能為- 9.2 kcal/mol，槲皮素-CYP2C9 結(jié)合能為-9.2 kcal/mol，槲皮素-ACACA結(jié)合能為-9.1 kcal/mol，山奈酚-POLD1 結(jié)合能為-9.1 kcal/mol， 山 奈 酚-CYP2C9 結(jié) 合 能 為-8.1 kcal/mol，山奈酚、槲皮素與4 個核心靶點蛋白結(jié)合能絕對值均較高，可能是中華獼猴桃根治療肝癌過程中發(fā)揮療效的關(guān)鍵成分。 槲皮素-POLD1、山奈酚-AKR1C3、槲皮素-CYP2C9 結(jié)合能的絕對值較高，分子對接圖見圖5。

圖4 藥物活性成分-靶點-潛在通路網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 分子對接模式圖(a. 山奈酚-AKR1C3；b. 槲皮素-CYP2C9；c. 槲皮素-POLD1)

3 討論

肝癌的發(fā)生發(fā)展與其代謝過程密不可分。 代謝重編在促進肝癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。 肝癌細胞為了快速生長、增殖的需要，發(fā)生一系列代謝重編過程以適應(yīng)生存環(huán)境，如糖酵解異?；钴S、脂肪酸從頭合成、氨基酸及核苷酸代謝異常活躍等。中華獼猴桃根具有清熱解毒、活血化瘀等功效，其可能通過調(diào)節(jié)肝癌細胞中能量代謝以抵抗腫瘤的生長侵襲。 此外，其還可以通過調(diào)節(jié)肝癌患者的氣血瘀滯、血脈不通等狀態(tài)，改善肝癌患者缺氧的微環(huán)境，影響癌細胞的能量合成，抑制腫瘤細胞快速增殖[8]。

腫瘤細胞的代謝重編涉及多種途徑[9-11]。 徐瑩等[12]研究表明，獼猴桃根提取物可促進Akt 基因表達，抑制其磷酸化，通過p-Akt/PTEN 信號通路抑制肝癌細胞增殖，阻滯細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡。 此外，He 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃根提取物還可以通過調(diào)控PCSK9 介導(dǎo)的信號通路抑制膽固醇代謝，進而產(chǎn)生抗肝癌活性。 這提示，中華獼猴桃根在肝癌代謝重編的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，并且可以通過多種機制進行調(diào)節(jié)。 本研究構(gòu)建了“中華獼猴桃根藥效化合物-靶基因-肝癌”網(wǎng)絡(luò)，最終得到AKR1C3、CYP2C9、ACACA、POLD1 這4 個肝癌預(yù)后代謝相關(guān)基因。 AKR1C3 高表達與肝癌患者較差的存活率相關(guān)，其可通過激活NF-κB 信號傳導(dǎo)，促進STAT3的磷酸化，參與MAPK/ERK 信號通路等正調(diào)控肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[14-15]。 CYP2C9 在正常肝組織中廣泛參與外源及內(nèi)源物質(zhì)的代謝，在調(diào)節(jié)細胞周期、細胞增殖及細胞凋亡中起重要作用。 有研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C9 高表達可能是有利的肝癌預(yù)后信號，因此，CYP2C9 可能作為進一步改善肝癌患者預(yù)后的治療靶點[16-17]。 耿西林等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ACACA 在肝癌細胞中表達上調(diào)，可通過促進Snail 介導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強細胞侵襲與遷移能力，進而促進肝癌轉(zhuǎn)移。 在腫瘤組織中，高表達的ACACA 可以促進脂肪生成以滿足腫瘤細胞的快速生長和增殖，抑制其活性可使腫瘤細胞脂肪酸合成受阻，達到抑制腫瘤生長及增殖的目的[19-20]。 歐賢紅等[21]研究發(fā)現(xiàn)，POLD1 基因表達與編碼蛋白的表達在肝癌組織中顯著高于癌旁組織，其上調(diào)與肝癌細胞的惡性增殖有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，中華獼猴桃根中的山奈酚和槲皮素是作用于AKR1C3、CYP2C9、ACACA、POLD1 這4 個靶點的主要活性成分。 山奈酚和槲皮素均屬于黃酮類化合物。 山奈酚在調(diào)節(jié)肝癌代謝紊亂、阻礙肝癌細胞生長方面具有重要價值，主要通過降低人肝癌細胞中的PI3K/AKT/mTOR 和p-mTOR 信號通路及缺氧誘導(dǎo)因子1 表達，增強Janus 激酶1、酪氨酸激酶2、STAT1/2、磷酸酶和張力蛋白同源物的表達，參與線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，抑制肝癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡[22]。 槲皮素在體內(nèi)外也具有較好的抗肝癌活性，主要通過抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1 表達，降低HK2 蛋白水平，調(diào)節(jié)P13K/Akt/mTOR 信號通路和MAPK/ERK1/2 信號通路，進而影響肝癌細胞中的葡萄糖代謝和細胞能量產(chǎn)生，抑制肝癌細胞轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)凋亡[23]。

綜上所述，槲皮素和山奈酚可能是中華獼猴桃根干預(yù)肝癌細胞代謝重編過程中起主要活性的藥效成分，其可能通過作用于AKR1C3、CYP2C9、ACACA、POLD1 這4 個靶點，參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞中的代謝重編過程。 本研究存在一定不足，本研究僅在理論水平初步預(yù)測了中華獼猴桃根治療肝癌的作用機制，有待開展相關(guān)實驗研究進一步分析。