潘 雅，黃家軍，黃繼紅，蘇炳澤，王海妹，陳賽明

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，海口 570203)

鼻咽癌是廣東等地區(qū)的常見惡性腫瘤，多數(shù)屬于非角化癌，對(duì)電離輻射敏感性較高，因此臨床上多通過(guò)放射治療進(jìn)行鼻咽癌的治療[1]。放射治療中通過(guò)射線造成DNA分子的斷裂、交聯(lián)，直接損傷癌細(xì)胞的DNA，同時(shí)通過(guò)引發(fā)瘤體內(nèi)水分子電離的方式產(chǎn)生對(duì)癌細(xì)胞DNA分子造成損傷的自由基[2]。鼻咽癌具備輻射劑量依賴型，放射劑量的提高在增加腫瘤局部控制率的同時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)腦神經(jīng)麻痹、顳葉壞死等問題，降低患者生存率，因此提高癌細(xì)胞放射敏感性是有效控制鼻咽癌的重點(diǎn)內(nèi)容[3-4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，敲除生殖器形成抑制基因-1(suppressor with morphogenetic effect on genitalia-1，SMG-1)后，癌細(xì)胞放射敏感性提高[5]。因此本研究探討了shRNA靶向干擾SMG-1表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA-SMG-1有效干擾序列的人源性鼻咽癌CNE-2細(xì)胞(西南醫(yī)科大學(xué))，轉(zhuǎn)染SMG-1無(wú)效干擾序列的人源性鼻咽癌CNE-2細(xì)胞(西南醫(yī)科大學(xué))，野生型人源性鼻咽癌CNE-2細(xì)胞(南方醫(yī)科大學(xué))。24只3～4周齡的雌性BALB/c-nu小鼠(成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，于無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.1.2儀器與試劑

胎牛血清(FBS)、RPMI改良培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)；100×青霉素-鏈霉素溶液、胰酶細(xì)胞消化液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)干粉、二甲基亞砜(DMSO)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(瑞士Roche公司)。游標(biāo)卡尺(瑞典醫(yī)科達(dá)公司)；液氮罐、高速離心機(jī)、石蠟切片機(jī)(四川海盛杰低溫科技有限公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；高壓滅菌鍋、恒溫水浴箱(美國(guó)PolyScience公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組

將實(shí)驗(yàn)裸鼠隨機(jī)分為A組(未放射)、B組(放射)，隨后根據(jù)接種細(xì)胞的不同，將A、B組裸鼠再分別劃分為接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA-SMG-1有效干擾序列的N-CNE-2SH組、Y-CNE-2SH組，接種轉(zhuǎn)染SMG-1無(wú)效干擾序列的N-CNE-2MG組、Y-CNE-2MG組，未經(jīng)任何處理的野生型鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的N-CNE-2組、Y-CNE-2組，每組4只。

1.2.2主要溶液配制

pH 7.2～7.4的PBS：于PBS干粉中加雙蒸水定容至2 000 mL，分裝，滅菌，冷卻后4 ℃密封保存。完全培養(yǎng)基：5.0 mL FBS混合0.5 mL青霉素-鏈霉素溶液，再加入RPMI改良培養(yǎng)基至50.0 mL。凍存液：1.0 mL DMSO中加FBS至10.0 mL，4 ℃預(yù)冷保存。

1.2.3人源性鼻咽癌CNE-2細(xì)胞處理

37 ℃恒溫水浴箱解凍60 s，融化后轉(zhuǎn)移至離心管低速離心(1 000 r/min離心3 min)，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基，重懸為單個(gè)細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿，置于孵箱常溫培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，棄舊培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，半數(shù)細(xì)胞懸浮時(shí)，加入完全培養(yǎng)基終止消化；收集細(xì)胞懸浮液，離心管低速離心(1 000 r/min離心3 min)，棄上清液，加完全培養(yǎng)基，一部分重懸傳代，一部分加入4 ℃預(yù)冷凍存液凍存。凍存管密封，依次按4 ℃ 30 min、-20 ℃ 1 h、-80 ℃過(guò)夜處理后，移入液氮罐中。按傳代法收集細(xì)胞后，加入完全培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，滴入消毒后的血球計(jì)數(shù)板中，按“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右，2個(gè)及以上粘連細(xì)胞團(tuán)計(jì)為1個(gè)細(xì)胞”的原則進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4裸鼠皮下移植瘤模型建立

分別收集處于指數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2SH細(xì)胞、CNE-2MG細(xì)胞、CNE-2細(xì)胞，PBS洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)后分成2份，一份加入PBS制成濃度為1×107/mL的3種接種液；一份直接接受不同劑量的輻射照射。對(duì)裸鼠左右后側(cè)大腿處皮膚消毒后，將CNE-2SH細(xì)胞分別接種于N-CNE-2SH組、Y-CNE-2SH組；CNE-2MG細(xì)胞分別接種于N-CNE-2MG組、Y-CNE-2MG組；CNE-2細(xì)胞分別接種于N-CNE-2組、Y-CNE-2組。接種后第22天Y-CNE-2SH組、Y-CNE-2MG組、Y-CNE-2組采用局部放射治療，皮源距100 cm，輻射劑量2 Gy/次，劑量率200 cCy/min，治療頻率每天1次，連續(xù)5 d。

1.2.5蘇木素-伊紅(HE)染色

細(xì)胞接種后第40天處死全部裸鼠，剝離移植瘤，移植瘤稱質(zhì)量后，進(jìn)行石蠟包埋，通過(guò)HE染色觀察移植瘤組織學(xué)特點(diǎn)。HE染色中，首先將剝離后的移植瘤切片放置烤箱中以67 ℃烘烤2 h，烘烤后進(jìn)行二甲苯脫蠟處理，并進(jìn)行梯度乙醇水合，不同濃度乙醇各處理5 min。然后自來(lái)水沖洗病理切片，使用蘇木素染液染色，10 min后自來(lái)水將多余的染液沖洗，再利用1%鹽酸乙醇褪色操作，自來(lái)水將其沖洗至藍(lán)色，使用伊紅染色1 min。最后采用梯度乙醇脫水，各濃度乙醇脫水5 min，后使用二甲苯處理病理切片，中性橡膠封片，將其置于顯微鏡下觀察移植瘤組織學(xué)特點(diǎn)。

1.2.6末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法

以TUNEL法進(jìn)行凋亡細(xì)胞的原位檢測(cè)，細(xì)胞核染成棕色的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。置于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，并進(jìn)行凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)，取平均凋亡細(xì)胞數(shù)描述瘤體組織中癌細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.7四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)

將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2SH細(xì)胞、CNE-2MG細(xì)胞、CNE-2細(xì)胞分別接種到96孔板中(5×103個(gè)/孔)。孵育過(guò)夜后，用不同的放射劑量(0、2、4、6、8 Gy)照射細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理細(xì)胞48 h后，向96孔板的每個(gè)孔中加入10 μL MTT溶液(0.5 mg/mL)。孵育4 h后，倒掉每孔的上清液，并加入100 μL DMSO溶液。最后用微孔板分光光度計(jì)檢測(cè)490 nm處的吸光度。

1.2.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

將CNE-2SH細(xì)胞、CNE-2MG細(xì)胞、CNE-2細(xì)胞接種至6孔板中，過(guò)夜孵育后，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行放射處理(輻射劑量2 Gy/次，劑量率200 cCy/min)。收集細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次。加入100 μL結(jié)合緩沖液制備成懸浮液(1×106個(gè)/mL)。將懸液與Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)結(jié)合緩沖液中在室溫下避光孵育15 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠移植瘤體積變化

6組裸鼠均形成可持續(xù)生長(zhǎng)的結(jié)節(jié)，成瘤率100%。與N-CNE-2組、N-CNE-2MG組比較，N-CNE-2SH組裸鼠移植瘤的瘤體體積減小(t=15.633，P<0.05；t=11.938，P<0.01)；N-CNE-2組與N-CNE-2MG組瘤體體積比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.324，P=0.243)。N-CNE-2SH組的體積抑瘤率為38.60%。放射后，與Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組比較，Y-CNE-2SH組裸鼠移植瘤的瘤體體積減小(t=16.621，P<0.05；t=17.921，P<0.05)；Y-CNE-2組與Y-CNE-2MG組瘤體體積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.670，P=0.156)。Y-CNE-2SH組的體積抑瘤率為64.88%。與放射前比較，放射后3組裸鼠的瘤體體積均明顯減小(P<0.05)。

2.2 裸鼠移植瘤重量變化

N-CNE-2SH組的瘤體重量明顯小于N-CNE-2組、N-CNE-2MG組的瘤體重量(F=5.180，P<0.05)，質(zhì)量抑瘤率為50.70%。Y-CNE-2SH組的瘤體重量明顯小于Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組(F=5.429，P<0.05)，質(zhì)量抑瘤率為70.65%，見圖1、2。Y-CNE-2SH組瘤體重量小于N-CNE-2SH組(P<0.05)。

圖1 細(xì)胞接種第40天放射各組裸鼠情況

2.3 裸鼠移植瘤HE染色結(jié)果

N-CNE-2組、N-CNE-2MG組中裸鼠瘤體組織切片中癌細(xì)胞排列緊湊，細(xì)胞核偏大，染色較深，并未出現(xiàn)分辨性強(qiáng)的壞死區(qū)域；而N-CNE-2SH組裸鼠瘤體組織切片中出現(xiàn)明顯灶狀壞死區(qū)，該區(qū)域內(nèi)存在癌細(xì)胞核固縮、破裂現(xiàn)象，且細(xì)胞質(zhì)紅染區(qū)域增大。Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組裸鼠瘤體組織切片中出現(xiàn)局灶狀壞死區(qū)，部分區(qū)域出現(xiàn)癌細(xì)胞核固縮、破裂，細(xì)胞質(zhì)紅染區(qū)域增大等現(xiàn)象。相比于其他5組，Y-CNE-2-SH組中裸鼠瘤體組織切片內(nèi)出現(xiàn)大片液化壞死區(qū)，處于該區(qū)域內(nèi)的癌細(xì)胞核發(fā)生固縮、破裂、溶解，且伴隨著細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大片紅染區(qū)域，見圖3。

圖2 各組裸鼠移植瘤重量變化

圖3 各組裸鼠移植瘤HE染色結(jié)果

2.4 裸鼠移植瘤內(nèi)癌細(xì)胞凋亡情況

接種相同癌細(xì)胞的前提下，與A組各亞組細(xì)胞比較，B組對(duì)應(yīng)各亞組癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)均呈明顯的增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。N-CNE-2SH組裸鼠癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于N-CNE-2組與N-CNE-2MG組(t=3.867、3.557，P=0.031、0.038)。Y-CNE-2SH組裸鼠癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組(t=6.223、5.657，P=0.002、0.005)，見圖4、5。

圖4 各組癌細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400)

2.5 放射各組細(xì)胞存活情況

Y-CNE-2組細(xì)胞凋亡率為3.5%，明顯低于Y-CNE-2MG組的8.0%和Y-CNE-2SH組的12.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

不同劑量輻射下，放射各組存活分?jǐn)?shù)均隨著輻射劑量的增大而逐漸降低。Y-CNE-2SH組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)明顯少于Y-CNE-2MG組與Y-CNE-2組。隨著輻射劑量的增加，Y-CNE-2SH組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)下降幅度多于Y-CNE-2MG組與Y-CNE-2組，見圖7。

圖5 各組裸鼠癌細(xì)胞凋亡情況

圖6 放射各組流式細(xì)胞圖

圖7 MTT法檢測(cè)不同放射劑量的放射各組細(xì)胞存活曲線

3 討 論

2018年，全球鼻咽癌發(fā)病12.9萬(wàn)例，占全球癌癥總發(fā)病率的0.7%，我國(guó)95%以上鼻咽癌屬于非角化癌，對(duì)電離輻射具有高度敏感特性[6]。鼻咽癌屬于一種劑量依賴型腫瘤，放射劑量的提高對(duì)腫瘤局部控制十分有利，但由此易引發(fā)患者出現(xiàn)腦神經(jīng)麻痹、吞咽困難等問題，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[7]。因此提高鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性成為控制鼻咽癌的有效手段。射線可通過(guò)直接損傷腫瘤細(xì)胞DNA進(jìn)行抗癌治療，同時(shí)放射線還可通過(guò)促使瘤體內(nèi)水分子電離生成自由基，間接作用于DNA分子損傷癌細(xì)胞DNA[8-9]。SMG-1為哺乳動(dòng)物體內(nèi)PIKK家族成員之一，參與無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解(non-sense mRNA decay，NMD)途徑，通過(guò)該途徑降解無(wú)義突變產(chǎn)生的含有提前終止密碼子的mRNA，防止?jié)撛诙拘缘鞍椎纳蒣10-11]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，SMG-1參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，且SMG-1基因敲除后，腫瘤細(xì)胞的放射敏感性明顯提高[12]。

有研究認(rèn)為通過(guò)siRNA技術(shù)下調(diào)SMG-1表達(dá)，可在一定程度上提高癌細(xì)胞對(duì)放射的敏感度，達(dá)到改善患者預(yù)后的目的[13]。本研究通過(guò)移植瘤瘤體的體積與重量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)監(jiān)測(cè)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況，Y-CNE-2SH組裸鼠移植瘤瘤體體積減小幅度大于Y-CNE-2MG組、Y-CNE-2組，Y-CNE-2SH組的體積抑瘤率為64.88%。N-CNE-2SH組的移植瘤瘤體重量明顯小于N-CNE-2組、N-CNE-2MG組，重量抑瘤率為50.70%；Y-CNE-2SH組的瘤體重量明顯小于Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組，重量抑瘤率為70.65%；Y-CNE-2MG組瘤體重量明顯小于N-CNE-2SH組。說(shuō)明接種CNE-2SH細(xì)胞的裸鼠移植瘤細(xì)胞的放射敏感性強(qiáng)于接種CNE-2MG細(xì)胞、CNE-2細(xì)胞的放射敏感性。

根據(jù)已有文獻(xiàn)可知，顯微鏡下鼻咽癌癌細(xì)胞分布呈巢狀、排列紊亂，細(xì)胞大小、形態(tài)不同，細(xì)胞核體積大，且存在核分裂不一現(xiàn)象，細(xì)胞異型性明顯等組織學(xué)特點(diǎn)[14-15]。HE染色結(jié)果顯示N-CNE-2組、N-CNE-2MG組中癌細(xì)胞排列緊湊，并未出現(xiàn)分辨性強(qiáng)的壞死區(qū)域；N-CNE-2SH組中癌細(xì)胞核固縮、破裂，有明顯灶狀壞死區(qū)。Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組部分區(qū)域出現(xiàn)癌細(xì)胞核固縮、破裂，有局灶狀壞死區(qū)出現(xiàn)；Y-CNE-2SH組中出現(xiàn)大片液化壞死區(qū)，癌細(xì)胞核發(fā)生固縮、破裂、溶解，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大片紅染區(qū)域。從凋亡細(xì)胞數(shù)上分析，B組各亞組的癌細(xì)胞凋亡數(shù)高于A組對(duì)應(yīng)亞組；Y-CNE-2SH組癌細(xì)胞凋亡數(shù)多于Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組；N-CNE-2SH組癌細(xì)胞凋亡數(shù)多于N-CNE-2組、N-CNE-2MG組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示同一劑量輻射下，Y-CNE-2SH組(12.1%)細(xì)胞的凋亡率明顯高于Y-CNE-2組(3.5%)、Y-CNE-2MG組(8.0%)。結(jié)合文獻(xiàn)可知，shRNA靶向干擾SMG-1表達(dá)有利于鼻咽癌癌細(xì)胞的控制，同時(shí)通過(guò)促進(jìn)瘤體細(xì)胞凋亡的方式提高癌細(xì)胞放射敏感性。

綜上所述，shRNA靶向干擾SMG-1表達(dá)可在一定程度上抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞瘤體的生長(zhǎng)，提高瘤體細(xì)胞凋亡率；shRNA靶向干擾SMG-1表達(dá)聯(lián)合放療對(duì)瘤體生長(zhǎng)抑制作用更為明顯，同時(shí)具備更有效的促癌細(xì)胞凋亡作用，即shRNA靶向干擾SMG-1表達(dá)可提高鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性。