張瑞華 ， 于永樂 ， 張 鴻 ， 李煥發(fā) ， 高善頌 ， 陳 超 ， 張丹萍 ， 竇心怡 ， 韓先杰

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica，Bb) 是一種革蘭陰性小桿菌或球桿菌[1]，在血平板上37 ℃培養(yǎng)48 h的菌落直徑為0.5～1 mm，眼觀菌落呈圓形，邊緣整齊[2]。支氣管敗血波氏桿菌是一種潛在的人獸共患病病原體，主要引起人類和多種動(dòng)物的呼吸道疾病[3]，能在某些哺乳動(dòng)物中定居，并能引起動(dòng)物機(jī)體呼吸道發(fā)生隱性感染或急、慢性炎癥，且能夠引起人類的感染導(dǎo)致免疫功能低下的患者罹患復(fù)發(fā)性菌血癥和肺炎[4-5]。

支氣管敗血波氏桿菌有多個(gè)毒力因子，如菌毛(Fimbriae)、皮膚壞死毒素(Demronecrotic toxin，DNT)、腺苷酸環(huán)化酶溶血素(Adenylate cyclase-hemolisin，AC-Hly)、百日咳桿菌黏附素(Pertactin，Prn)、內(nèi)膜感受器組氨酸激酶(bvgs)、外源鐵載體受體(brfZ)、氣管細(xì)胞毒素(Tracheal cytotoein)和菌毛血凝素(Filmanetous hemagglutinin，F(xiàn)HA)。本試驗(yàn)從山東省膠東地區(qū)分離出8株疑似豬支氣管敗血波氏桿菌，為了研究豬支氣管敗血波氏桿菌的毒力基因，通過PCR方法對DNT、brfZ、AC-Hly、bvgs、FHA基因和Prn基因進(jìn)行檢測，為該菌的致病性研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 于2018—2020年分離自山東省膠東地區(qū)某些發(fā)生呼吸道綜合征豬場的病死豬肺臟。8株分離菌的具體信息見表1。

表1 菌株來源Table 1 Strain source

1.2 主要試劑 50×TAE電泳緩沖液、PCR試劑(2×PCR Buffer、dNTPs、ExTaq酶)、DL2 000 DNA Marker、瓊脂糖、核酸染料,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；博檢氏革蘭陰性菌鑒定系統(tǒng)、革蘭染色試劑、綿羊血平板，均購自青島高科園海搏生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與純化 無菌條件下取病死豬的肺臟劃線接種到血瓊脂平板上，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24～36 h；挑取大小、形態(tài)及顏色基本一致的菌落再次接種至血瓊脂平板，然后在血平板上進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)并將其放在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h后取出，仔細(xì)觀察細(xì)菌的培養(yǎng)狀況。挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色鑒定。挑取單菌落至腦心浸液肉湯中增殖培養(yǎng)。

1.4 生化試驗(yàn) 將菌液離心后使用生理鹽水洗滌2次，將菌體重懸后接種到精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、枸櫞酸鹽、脲酶、硫化氫、氧化酶、乳糖、鄰硝基酚β-D-半乳糖吡喃苷(Ortho-nitrophenyl-β-galactoside,ONPG)、3-羥基丁酮(Voges-proskauer,V-P)、吲哚、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蜜二糖、苦杏仁甙、明膠和肌醇中，放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果判定。

1.5 PCR鑒定 采用煮沸法提取DNA，根據(jù)St?pniewska等[6]的方法合成針對鞭毛(Flagella,FLA)基因的特異性引物(表2)，通過PCR方法對豬支氣管敗血波氏桿菌進(jìn)行檢測。

1.6 毒力基因的檢測 采用 PCR方法對該細(xì)菌的主要毒力基因進(jìn)行檢測。這些毒力基因均通過GenBank進(jìn)行序列分析比對，使用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表2)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 PCR引物信息Table 2 PCR primer details

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×Master Mix 12.5 μL，上游引物(F)1.0 μL，下游引物(R)1.0 μL，DNA模板1.5 μL，無菌水9.0 μL。其中，根據(jù)堿基(G+C)和(A+T)的含量以及預(yù)期擴(kuò)增片段大小得到各毒力基因的反應(yīng)條件。bfrZ、FHA基因和AC-Hly基因的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物置4 ℃保存。FLA、bvgs基因和DNT基因的退火溫度改為56 ℃，Prn基因的延伸時(shí)間為60 s，其他反應(yīng)條件不變。PCR產(chǎn)物經(jīng)120V電泳20 min后使用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照留存。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)特性與形態(tài)特征 分離菌在血平板上生長緩慢，24 h長出的菌落似針尖大小，48 h長出的菌落似針頭大小，灰黃色、圓形、微隆起(圖1)。革蘭染色結(jié)果為革蘭陰性短小桿菌，呈單個(gè)存在(圖2)。

圖1 分離菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of isolated strains

圖2 分離菌革蘭染色 (1 000×) Fig.2 Gram staining of isolated strains (1 000×)

2.2 生化試驗(yàn) 如表3所示，分離菌能分解精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、枸櫞酸鹽和脲酶，氧化酶試驗(yàn)呈陽性，不產(chǎn)生硫化氫，不分解乳糖、蔗糖等多種糖類，ONPG、V-P和吲哚試驗(yàn)均為陰性，試驗(yàn)結(jié)果符合支氣管敗血波氏桿菌的生化特點(diǎn)。

表3 生化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of biochemical test

2.3 PCR鑒定 對8株分離菌進(jìn)行FLA基因PCR擴(kuò)增并通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增片段大小約為237 bp(圖3)，分別將其命名為Bb-1、Bb-2、Bb-3、Bb-4、Bb-5、Bb-6、Bb-7和Bb-8。

圖3 FLA基因的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of FLA geneM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2 000； 1～8：Bb-1～Bb-8M:DL2 000 DNA Marker; 1-8:Bb-1-Bb-8

2.4 毒力基因的檢測 毒力基因的PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果如表4和圖4～9所示。結(jié)果顯示，毒力基因DNT的檢出率為87.5%，毒力基因bvgs的檢出率為100%，毒力基因AC-Hly的檢出率為100%，毒力基因FHA的檢出率為87.5%，毒力基因bfrZ的檢出率為100%，毒力基因Prn的檢出率為100%。

表4 豬支氣管敗血波氏桿菌主要毒力基因的分布情況Table 4 Distribution of main virulence genes in Bordetella bronchiseptica strains from swine

圖4 DNT基因的PCR擴(kuò)增Fig.4 PCR amplification of virulence gene DNTM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2 000； 1～8：Bb-1～Bb-8M:DL2 000 DNA Marker; 1-8:Bb-1-Bb-8

圖5 bvgs基因的PCR擴(kuò)增Fig.5 PCR amplification of virulence gene bvgsM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2 000； 1～8：Bb-1～Bb-8M: DL2 000 DNA Marker; 1-8:Bb-1-Bb-8

圖6 AC-Hly基因的PCR擴(kuò)增Fig.6 PCR amplification of virulence gene AC-HlyM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2 000； 1～8：Bb-1～Bb-8M: DL2 000 DNA Marker; 1-8:Bb-1-Bb-8

3 討論

本試驗(yàn)分離菌的菌落在血平板上呈灰黃色、圓形、微隆起，這一菌落特點(diǎn)與張棟良等[7]的研究結(jié)果一致，但在該菌培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)菌株在24 h左右并未出現(xiàn)明顯的菌落聚集，在24～36 h時(shí)，多數(shù)菌株出現(xiàn)較為典型的菌落形態(tài)，但是有個(gè)別菌株的菌落并不典型，并且有些已出現(xiàn)典型菌落的平板再置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)約4 h后，其菌落出現(xiàn)了不同程度的變化。通過細(xì)菌生化和PCR鑒定后，確定了這8株分離菌均為Bb，以此判斷該菌可能出現(xiàn)了菌相變異，在以后對該菌進(jìn)行研究時(shí)，應(yīng)注意這一特性變化。

圖7 FHA基因的PCR擴(kuò)增Fig.7 PCR amplification of virulence gene FHAM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2 000； 1～8：Bb-1～Bb-8M: DL2 000 DNA Marker; 1-8:Bb-1-Bb-8

圖8 bfrZ基因的PCR擴(kuò)增Fig.8 PCR amplification of virulence gene bfrZM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2 000；1～8：Bb-1～Bb-8M: DL2 000 DNA Marker; 1-8: Bb-1-Bb-8

圖9 Prn基因的PCR擴(kuò)增Fig.9 PCR amplification of virulence gene PrnM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2 000；1～8：Bb-1～Bb-8M: DL2 000 DNA Marker; 1-8: Bb-1-Bb-8

支氣管敗血波氏桿菌的毒力基因有許多，本試驗(yàn)檢測到的主要毒力基因中bvgs基因可根據(jù)環(huán)境條件的變化而發(fā)生改變，這一特性是通過調(diào)節(jié)多種毒力因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。FHA基因具有良好的抗原保護(hù)性[8],它和DNT基因都有利于豬支氣管敗血波氏桿菌的黏附作用，并且從肖璐等[9]的研究中可知，DNT基因?qū)C(jī)體的皮膚還有明顯的毒性作用。AC-Hly基因可以裂解紅細(xì)胞，并能使巨噬細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞的吞噬作用受到破壞從而發(fā)揮毒性作用[10]，而Prn基因?qū)奘杉?xì)胞也具有一定的毒素作用，從而有利于細(xì)菌在宿主體內(nèi)生存。前人研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌毒力基因的分布并不一致，與本試驗(yàn)結(jié)果相吻合，毒力基因DNT和FHA的檢出率均為87.5%，毒力基因bvgs、AC-Hly、bfrZ和Prn的檢出率均為100%。