穆洪云 ， 張儉偉

[1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 ， 江蘇 泰州 225300 ； 2.勃林格殷格翰動(dòng)物保健(上海)有限公司 ， 上海 靜安 200040]

在全球范圍內(nèi)，蜱媒病不斷威脅著人類及犬的健康，包括我國在內(nèi)，有著越來越多蜱媒病的病例。蜱蟲是多種疾病的傳播媒介，如巴貝斯蟲病、埃里希體病、無形體病、立克次體病、萊姆病等[1-2]。這些蜱媒病不僅嚴(yán)重危害犬的健康，同時(shí)還威脅著人類的生命安全。隨著氣候變暖和環(huán)境變化，以及新發(fā)和再發(fā)蜱媒病的出現(xiàn)，蜱媒病在國內(nèi)外均已引起廣泛關(guān)注[3-4]。近幾年，在我國發(fā)現(xiàn)了多個(gè)人粒細(xì)胞無形體病及發(fā)熱伴血小板減少綜合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)病例，并出現(xiàn)了死亡病例，引起了人們越來越多的關(guān)注，也讓大家更加重視蜱及蜱媒病的預(yù)防，同時(shí)也需要更多關(guān)于蜱媒病的流行病學(xué)資料[5-7]。本調(diào)查以我國20個(gè)城市門診寵物犬為對(duì)象，進(jìn)行犬常見蜱媒病的檢測，結(jié)合之前的蜱蟲種類及分布調(diào)查，以期為我國犬的蜱及蜱媒病防治提供基礎(chǔ)資料，為蜱媒病的正確預(yù)防提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 血清樣本采集和處理 選定20個(gè)城市，每個(gè)城市中選擇3～5家寵物醫(yī)院，每家采集5～10份犬血液樣本，每只犬采集0.5～1.0 mL血液，分離血清，保存于-30 ℃?zhèn)溆?，各樣本信息登記編?hào)。

1.2 試劑與儀器 SNAP-4DX Plus檢測試劑盒，購自美國IDEXX公司；吉氏巴貝斯蟲人工感染的犬陽性血清、田鼠巴貝斯蟲人工感染的犬陽性血清和正常犬血清，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所提供。血清檢測酶標(biāo)儀為MOLECULAR DEVIECS，SPECTRA MAX M5。

1.3 犬的蜱媒病的檢測

1.3.1 犬感染萊姆病、無形體病和埃里希體病的檢測 按SNAP-4DX Plus檢測試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行檢測。簡述如下，取待測血清樣本約150 μL置于反應(yīng)管中，加200 μL檢測試劑充分混合，混合物加入檢測裝置的樣本孔，30～60 s后樣本液到達(dá)激活孔，該孔一旦顯色，立即按下激活裝置，8 min后觀察結(jié)果。

1.3.2 犬感染吉氏巴貝斯蟲和田鼠巴貝斯蟲的血清學(xué)檢測 吉氏巴貝斯蟲的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法參照參考文獻(xiàn)[8]建立的方法，包被抗原為大腸埃希菌重組表達(dá)的吉氏巴貝斯蟲P50抗原。

田鼠巴貝斯蟲的ELISA方法參照參考文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道的方法，包被抗原為大腸埃希菌重組表達(dá)的田鼠巴貝斯蟲截短型分泌抗原(BmSA1)。

ELISA方法簡述：(1)用包被液將重組蛋白抗原稀釋至1 μg/mL，100 μL/孔，每一樣本做復(fù)孔，空白對(duì)照加GST 蛋白；(2)4 ℃，包被過夜；(3)傾去抗原液，用PBST洗滌3次，每次5 min，紙巾上拍干；(4)加封閉液，200 μL/孔，37 ℃，濕盒內(nèi)封閉1 h；(5)傾去封閉液，用PBST洗滌，方法同上；(6)用PBST稀釋待檢血清(1∶100)，37 ℃，濕盒內(nèi)溫育1 h；(7)傾去待檢血清，用PBST洗滌，方法同上；(8)用PBST將辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗犬IgG 1∶4 000稀釋，100 μL/ 孔，37 ℃，濕盒內(nèi)溫育1 h；(9)傾去二抗，用PBST洗滌，方法同上；(10)加入新配制的ABTS酶底物液，100 μL/孔，37 ℃，濕盒內(nèi)避光反應(yīng)30 min；(11)用酶標(biāo)儀在波長415 nm處測OD值。選用相應(yīng)的巴貝斯蟲感染的陽性血清和正常犬血清(陰性血清)作試驗(yàn)對(duì)照，待測樣本OD值為復(fù)孔平均值減去GST對(duì)照孔平均值，其大于0.25判為陽性(30個(gè)正常犬血清平均OD值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)誤)。

2 結(jié)果

2.1 樣本采集和制備 本調(diào)查中從我國20個(gè)主要城市采集樣本，涉及我國中東部16個(gè)省、直轄市，共采集到寵物犬血清562份，見表1。

表1 犬血清樣本采集和制備Table 1 Collection and preparation of blood samples from pet dogs

2.2 犬蜱媒病檢測

2.2.1 犬3種常見病的檢測 應(yīng)用商業(yè)化SNAP-4DX Plus檢測試劑盒進(jìn)行了萊姆病、無形體病和埃里希體病的檢測。對(duì)526份可檢測血清(562份樣本中有36份血清因分離量較少，不能檢測)的測定發(fā)現(xiàn)，萊姆病檢測到2份，感染率為0.38%；埃里希體病檢測到7份，感染率為1.33%；無形體病檢測到14份，感染率為2.66%。表明我國犬體均存在3種常見病，感染率較高的是無形體病和埃里希體病。來自上海、杭州等幾個(gè)城市的疾病種類較多、感染率較高，檢測結(jié)果見表2。

表2 萊姆病、埃里希體病和無形體病的血清學(xué)檢測Table 2 Serological tests for Lyme disease,ehrlichiosis and anaplasmosis

2.2.2 犬田鼠巴貝斯蟲和吉氏巴貝斯蟲病的檢測 對(duì)本次采集的全部血清樣本(562份)進(jìn)行了檢測，結(jié)果如表3所示，寵物犬的田鼠巴貝斯蟲感染率為19.57%，吉氏巴貝斯蟲感染率為3.91%；20個(gè)城市中，除青島外，均有田鼠巴貝斯蟲感染，且感染率介于5.71%～60.00%，顯示了很高的感染程度；石家莊等8個(gè)城市樣本中未發(fā)現(xiàn)吉氏巴貝斯蟲陽性，其他12個(gè)城市感染率介于1.75%～16.67%，也顯示了普遍感染的特征。

表3 寵物犬田鼠巴貝斯蟲和吉氏巴貝斯蟲感染的ELISA檢測Table 3 ELISA detection of Babesia microti and Babesia gibsoni in pet dogs

3 討論

本項(xiàng)工作調(diào)查了我國20個(gè)主要城市寵物犬蜱媒病感染情況，采集了具有較多數(shù)量和地域代表性的樣本，是國內(nèi)關(guān)于犬蜱媒病的一次系統(tǒng)調(diào)查，檢測了多種蜱媒病的流行情況，試驗(yàn)結(jié)果可為國內(nèi)寵物犬蜱蟲及蜱媒病的防控提供研究基礎(chǔ)，進(jìn)而找到適合國內(nèi)情況的蜱媒病的防控措施。

本調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，我國寵物犬的常見蜱媒病中，犬埃里希體病、吉氏巴貝斯蟲病和無形體病陽性率較高，這與其他地方犬的情況相似。本調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了2例萊姆病的病例，陽性率為0.38%，這與墨西哥的一項(xiàng)寵物犬萊姆病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果相近(陽性率為0.2%)，略低于韓國的一項(xiàng)針對(duì)于軍犬的流行病學(xué)調(diào)查(陽性率為1.1%)，但陽性率比英國(陽性率為4.5%～11.0%)和美國(陽性率為1.4%～11.6%)的幾項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查低很多[11-15]。我國自1986年首次發(fā)現(xiàn)東北林區(qū)人群中存在萊姆病的發(fā)生和流行以來[16],現(xiàn)已證實(shí)29個(gè)省(市、區(qū))的人群中存在萊姆病的感染,并從病原學(xué)上證實(shí)了其中至少有19個(gè)省(市、區(qū))存在該病的自然疫源地,人群中有萊姆病的發(fā)生和流行。目前國內(nèi)有寵物犬的家庭越來越多，需要進(jìn)一步研究并重視萊姆病等這些人獸共患病在寵物犬的流行病學(xué)情況。

本調(diào)查中，ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明寵物犬吉氏巴貝斯蟲的陽性率為3.91%，這與在華東地區(qū)的另一項(xiàng)調(diào)查結(jié)果基本一致(陽性率為3.47%)。犬巴貝斯蟲病是犬的一種重要的以蜱蟲為媒介的血液寄生蟲病，它的診斷和治療目前仍然是寵物臨床醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。由于蜱蟲分布范圍的擴(kuò)大以及寵物犬在全球范圍的流動(dòng)，導(dǎo)致犬巴貝斯蟲病不斷擴(kuò)散。吉氏巴貝斯蟲一般是由血紅扇頭蜱、長角血蜱等蜱蟲傳播的。吉氏巴貝斯蟲是國內(nèi)寵物臨床常見的血液寄生蟲病例，特別是在蜱蟲多發(fā)的區(qū)域，它可導(dǎo)致溶血性貧血和全身炎癥反應(yīng)綜合征所導(dǎo)致的多器官功能障礙綜合征，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患犬死亡[17-18]。ELISA調(diào)查結(jié)果顯示，20個(gè)城市中的12個(gè)發(fā)現(xiàn)了吉氏巴貝斯蟲陽性病例，其中福州、鄭州、廣州、深圳、西安和成都均發(fā)現(xiàn)2例及以上病例，結(jié)合臨床情況，這些地區(qū)應(yīng)特別重視對(duì)吉氏巴貝斯蟲病的防控，特別需要寵物行業(yè)人員加強(qiáng)對(duì)寵主的教育，做好蜱蟲的防控。

本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，寵物犬的田鼠巴貝斯蟲感染率為19.57%，分布于本調(diào)查的19個(gè)城市中。田鼠巴貝斯蟲病是一種人獸共患的寄生蟲病，1969年美國加利福尼亞州檢測到首例人感染田鼠巴貝斯蟲病例，至今已有數(shù)千例人感染巴貝斯蟲感染病例的報(bào)道，且有逐年遞增的趨勢，根據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，僅在2011年，美國確診的人感染田鼠巴貝斯蟲病例就高達(dá)847例。其臨床癥狀范圍較廣，大部分患者為無癥狀感染，但一些特殊人群(如切除脾臟的人群、免疫低下患者和老年患者)則有致命危險(xiǎn)[19]。一般情況下，田鼠巴貝斯蟲的儲(chǔ)存宿主是嚙齒類動(dòng)物，本調(diào)查中雖然發(fā)現(xiàn)了大量的陽性病例，但關(guān)于犬是否是田鼠巴貝斯蟲的儲(chǔ)存宿主及對(duì)犬的危害還需要進(jìn)一步研究來確認(rèn)。

本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，上海和杭州均檢測到了犬萊姆病、埃里希體病、無形體病、田鼠巴貝斯蟲病和吉氏巴貝斯蟲病這5種蜱媒病的陽性病例，可能與這2個(gè)城市蜱蟲的分布及寵物數(shù)量有關(guān)系，因此做好蜱蟲及蜱媒病的防控非常重要。寵物醫(yī)院是蜱蟲及蜱媒病防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需要寵物醫(yī)生及寵物行業(yè)的從業(yè)者重視蜱媒病的診斷及預(yù)防，進(jìn)而去教育寵物主人，讓寵主意識(shí)到蜱蟲及蜱媒病的危害，只要寵主能夠按照寵物醫(yī)生的預(yù)防方案，每月進(jìn)行驅(qū)蟲，就可最大程度預(yù)防某些蜱媒病的發(fā)生。