李彥君，漆愛明，肖樹雄，曾子君

（廣東省藥品檢驗所 國家藥品監(jiān)督管理局化妝品風(fēng)險評估重點(diǎn)實驗室，廣東廣州 510300）

2019年11月起，歐盟委員會允許增加具有防腐和調(diào)理皮膚功能的羥基乙氧基苯基丁酮作為化妝品防腐劑。對羥基苯乙酮是一種天然植物提取物，具有防腐增效的作用，在較寬的pH和溫度范圍內(nèi)都有優(yōu)異的穩(wěn)定性。對茴香酸是一種天然存在于茴香中的有機(jī)酸，在酸性條件下可防止真菌霉素的合成，具有抗菌的功效。辛酰羥肟酸是一種有機(jī)酸，是選擇性強(qiáng)的金屬離子螯合劑，因其優(yōu)異的抑菌性能被廣泛應(yīng)用于化妝品中，在國外也有廣泛應(yīng)用。

對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸均在《已使用化妝品原料名稱目錄（2021年版）》[1]中，由于都具有抑菌的功效，同時不屬于《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中準(zhǔn)用的51類防腐劑[2]，常被商家添加到化妝品中并宣稱為“無防腐劑”化妝品，也稱之為防腐替代方案[3]。防腐替代方案普遍使用時間不長，缺乏安全評估數(shù)據(jù)，有必要對其添加量進(jìn)行監(jiān)管。目前，羥基乙氧基苯基丁酮尚未有國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，其余3種物質(zhì)都只有單組分檢測方法，無法應(yīng)用于多組分的同時測定[4-11]。因此本文通過建立相應(yīng)的檢測方法，以期為監(jiān)管表外防腐劑的添加情況提供技術(shù)支撐，同時為監(jiān)管部門日后制定相關(guān)限值要求提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

對羥基苯乙酮，純度98.25%，上海麥克林生化科技有限公司；羥基乙氧基苯基丁酮，純度97%，加拿大TRC公司；對茴香酸，純度99%，上海麥克林生化科技有限公司；辛酰羥肟酸，純度99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇，色譜純，德國默克公司；磷酸，分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

島津LC-20A液相色譜儀，日本SHIMADZU公司；Milli Q Reference超純水發(fā)生器，MILLIPORE公司；XS205DU十萬分之一電子天平，瑞士METTLER公司；CPA224S萬分之一電子天平，德國SARTORIUS公司；ElmaDE-78224超聲波清洗器，廣州市東南科創(chuàng)科技有限公司。

樣品來源：市面上購買，有針對性選取14批標(biāo)簽標(biāo)識有文中4種表外防腐劑的樣品及5批未標(biāo)識有文中4種表外防腐劑的樣品。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測器PDA，流動相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液（體積比20∶20∶60），等度洗脫，流速1 mL/min，掃描波長190～400 nm，檢測波長275 nm和210 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取50 mg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于不同25 mL容量瓶中，加入少量甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度，搖勻，得單標(biāo)儲備液。精密吸取對羥基苯乙酮和對茴香酸各0.4 mL、羥基乙氧基苯基丁酮和辛酰羥肟酸各2 mL于20 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)混合溶液0.125 mL、0.625 mL、1.250 mL、2.500 mL、5.000 mL和10.000 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。上機(jī)前均經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。

1.2.3 樣品處理

稱取樣品1.0 g（精確至0.000 1 g）于10 mL具塞比色管中（必要時，置于水浴中去除乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑），加甲醇定容至刻度，渦旋混勻，300 W超聲提取20 min。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

本研究分別考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液（體積比45∶55）、乙腈-0.1%磷酸水溶液（體積比35∶65）、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（體積比20∶20∶60）對4種表外防腐劑出峰情況的影響。由于部分化妝品存在同時添加表外防腐劑和表內(nèi)防腐劑的情況，因此建立的方法應(yīng)有效分離對茴香酸與常用防腐劑羥苯甲酯。結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液條件下，對茴香酸與羥苯甲酯出峰時間接近，光譜圖相似，存在干擾。而乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相時，各組分分離度和洗脫用時均優(yōu)于甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相。因此，選擇乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相，各組分分離情況如圖1所示。。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 檢測波長的選擇

在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果顯示，對羥基苯乙酮、對茴香酸和羥基乙氧基苯基丁酮的最大吸收波長分別為275 nm、254 nm和281 nm，在滿足靈敏度的前提下，為便于檢測，選擇275 nm為該3種組分的檢測波長。根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]選擇210 nm作為辛酰羥肟酸的檢測波長。

2.3 樣品前處理條件的選擇

研究甲醇和乙腈分別作為4種表外防腐劑提取溶劑時，在相同的色譜條件下，對目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)差異。結(jié)果表明，用甲醇作為提取溶劑時，各目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)均明顯優(yōu)于乙腈，且甲醇毒性低于乙腈。因此，選擇甲醇作為對照品提取溶劑。為減少溶劑效應(yīng)，選取甲醇作為樣品的提取溶劑。

以甲醇為提取溶劑，考察不同基質(zhì)化妝品在不同超聲時間下的回收率。在300 W超聲功率下，選取了10 min、20 min和30 min 3個時間點(diǎn)研究超聲時間與提取率關(guān)系。結(jié)果顯示，各基質(zhì)化妝品超聲提取20 min以上提取率沒有明顯變化。因此選擇以甲醇作為提取溶劑，超聲20 min作為樣品前處理條件。

2.4 線性關(guān)系

以各組分標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實驗結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，對羥基苯乙酮、對茴香酸、羥基乙氧基苯基丁酮和辛酰羥肟酸在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5。按S/N=3計算得出檢出限分別為 0.5 μg/g、1.0 μg/g、2.4 μg/g和7.5 μg/g（該濃度表示化妝品中的含量）。

2.5 回收率

取液體、乳液和膏霜3種不同基質(zhì)的空白樣品，分別添加3個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，每一水平設(shè)6個平行，按1.2.3樣品前處理方法制備待測樣品，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，計算回收率和精密度。由表2～5可知，該方法的回收率為92.3%～103.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤1.7%。結(jié)果表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表3 對茴香酸平均回收率和RSD

表4 羥基乙氧基苯基丁酮平均回收率和RSD

表5 辛酰羥肟酸平均回收率和RSD

2.6 精密度

考察了低、中、高3個質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度，日內(nèi)分析6次，連續(xù)測定3 d。由表6可知，各組分日內(nèi)精密度RSD為0.1%～1.0%；日間精密度RSD為0.3%～1.2%。實驗證明，該方法精密度高。

表6 日內(nèi)精密度和日間精密度（n=6）

2.7 重復(fù)性試驗

平行配制6份供試品溶液，在相同條件下上機(jī)測量，以6次測定值來考察方法重復(fù)性，計算得對羥基苯乙酮、對茴香酸、羥基乙氧基苯基丁酮和辛酰羥肟酸RSD分別為0.2%、0.2%、0.6%和1.2%（n=6），表明該方法重復(fù)性好。

2.8 實際樣品測定

應(yīng)用所建立的方法，對19批次3種不同劑型的化妝品進(jìn)行測定，并與標(biāo)簽進(jìn)行對比，結(jié)果見表7。

表7 樣品標(biāo)簽標(biāo)識情況和檢出情況

對19批樣品檢測結(jié)果進(jìn)行分析。（1）共有3批檢出標(biāo)簽未標(biāo)示組分對羥基苯乙酮，說明加入這些物質(zhì)而未標(biāo)識十分普遍。（2）羥基乙氧基苯基丁酮雖已列入歐盟準(zhǔn)用名單，但目前國內(nèi)還未列入已使用目錄，產(chǎn)品中沒發(fā)現(xiàn)添加，是否納入國內(nèi)準(zhǔn)用表有待研究后確定。（3）樣品中對羥基苯乙酮的含量在0.16%～0.69%、對茴香酸的含量在0.065%～0.090%、辛酰羥肟酸的含量在0.010%～0.048%，目前對這幾個物質(zhì)還沒設(shè)定限值，建議通過安全評估后設(shè)定合理限值。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法測定化妝品中4種表外防腐劑的含量測定方法。以甲醇作為提取溶劑，300 W超聲提取20 min，采用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行分離。經(jīng)過方法學(xué)考查，線性、回收率、精密度和重復(fù)性結(jié)果均在規(guī)定范圍內(nèi)，具有良好的適用性，為化妝品中4種表外防腐劑的含量測定提供了參考依據(jù)，能夠進(jìn)一步規(guī)范化妝品中防腐劑的使用。