吳紅松，秋田祐介

（1.日本埼玉工業(yè)大學(xué) 生命環(huán)境化學(xué)系，日本深谷 369-0293；2.菏澤學(xué)院 生物科學(xué)系，山東菏澤 274000）

松果菊是世界上最著名的藥用植物之一，近年來(lái)因其觀賞特性而備受關(guān)注。目前，針對(duì)松果菊的分子研究集中于遺傳多樣性，與花青素生物合成相關(guān)的基因研究鮮有報(bào)道。

類黃酮3'-羥化酶（Flavonoid 3'-Hydroxylase，F(xiàn)3'H），是花青素合成的關(guān)鍵基因，最初由BRUGLIERA等[1]從矮牽牛（Petunia hybrida）中分離并鑒定，目前已報(bào)道多種植物含有此基因。研究表明，F(xiàn)3'H負(fù)責(zé)B環(huán)3’位置的羥基化位置和程度，從而形成不同的花青素。因此，鑒定功能基因F3'H是了解松果菊中花青素羥基化和花色形成的重要步驟。研究發(fā)現(xiàn)松果菊F3'H（EpF3'H）的表達(dá)特點(diǎn)與菊花F3'H（CgF3'H）在菊花所有器官中的表達(dá)和百合F3'H（LvF3'H）在百合有色花瓣和無(wú)色花瓣中的表達(dá)結(jié)果相似[3-4]。EpF3'H的表達(dá)水平與花發(fā)育過(guò)程中花青素的形成和積累趨勢(shì)基本一致，可能具有協(xié)同促進(jìn)松果菊花瓣中花青素合成和積累的作用。但黃文坤等[5]發(fā)現(xiàn)F3'H在紫莖澤蘭類花瓣中的表達(dá)低于在葉中的表達(dá)，可見(jiàn)F3'H基因在不同品種、組織和生長(zhǎng)階段具有不同的時(shí)空表達(dá)模式，它們的組織特異性表達(dá)可能受調(diào)控基因的影響

本文利用3'-RACE和5'-RACE法克隆了EpF3'H的cDNA，并分析了該基因在不同組織中的表達(dá)，以便開(kāi)展針對(duì)松果菊花色的分子育種計(jì)劃。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

松果菊購(gòu)自Sakata Seed Co.（日本），室外栽培。采摘時(shí)將松果菊開(kāi)花階段分為四個(gè)時(shí)期，分別命名為S1、S2、S3和S4：S1——花瓣閉合，綠色（長(zhǎng)度小于15 mm）；S2——花瓣開(kāi)始著色（長(zhǎng)約20 mm）；S3——花瓣緋紅，剛剛綻開(kāi)（長(zhǎng)約20 mm）；S4——花瓣平展，花色紫紅（長(zhǎng)約30 mm）[2]。從不同開(kāi)花階段中收集花瓣和葉，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。收集后立刻液氮預(yù)冷，在RNA提取前儲(chǔ)存于-80 ℃。

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），日本Sigma；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，日本Takara；DNase I，日本Takara；3'-RACE和5'-RACE試劑盒，德國(guó)Roche。

T100型PCR儀，美國(guó)BIO；ABI 3730xl Analyzer型自動(dòng)測(cè)序儀，美國(guó)Applied Biosystems；QuantStudio?1型RT-PCR儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific。

1.2 EpF3'H全長(zhǎng)cDNA的克隆

從不同開(kāi)花階段（S1～S4）的花、葉中用CTAB法提取總RNA。2 μg RNA為模板，Oligo（dT） 21為引物，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄，DNase I處理，總體積20 μL，合成得EpF3'H的cDNA。使用3'-RACE和5'-RACE法擴(kuò)增F3'H基因的全長(zhǎng)cDNA片段。

設(shè)計(jì)一對(duì)引物EpF3'H-FP：5'-ATGACTATT CTAACCCTACTATCATACACC-3'，EpF3'H-RP：5'-TTAACCACTTTCATATACTTGAGG-3'。PCR 參 數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、90 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，分離、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，獲得全長(zhǎng)cDNA片段。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用Genetyx-ver 12軟件對(duì)不同植物F3’H蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，Clustalw多重比對(duì)的相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，bootstrap檢驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.4 生物信息學(xué)分析

測(cè)序得到的EpF3'H基因的序列信息提交到NCBI，通過(guò)BLAST與核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)搜索，利用NCBI查找開(kāi)放閱讀框（ORF），預(yù)測(cè)EpF3'H基因編碼蛋白的理化性質(zhì)。

1.5 表達(dá)分析

采用SYBR green熒光染料進(jìn)行RT-PCR，每個(gè)PCR反應(yīng)總體積20 μL，引物EpF3'H-FP1：5'-ACAGTGGAATGGGCAATAGC-3'，EpF3'H-RP：5'-TTAACCACTTTCATATACTTGAGG-3'。采用 2-??Cq計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量，以EpACT1作為內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 EpF3'H基因全長(zhǎng)cDNA序列的合成

通過(guò)3'-RACE和5'-RACE擴(kuò)增出cDNA的3'和5'端，從而獲得EpF3'H的全長(zhǎng)cDNA序列。ORF為1 533 bp，編碼510個(gè)氨基酸（GenBank登錄號(hào)OL828207），蛋白分子量為56.49 kD，pI為8.46。通過(guò)與NCBI上已登錄的菊花、郁金香、葡萄等的F3'H蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)克隆的基因?yàn)镕3'H基因。

2.2 EpF3'H的同源性和結(jié)構(gòu)特征

從NCBI Blast的比對(duì)結(jié)果中選取來(lái)源于其他24種植物的F3'H蛋白與松果菊EpF3'H蛋白，用相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖1）。從圖1中可以看出，不同物種來(lái)源的F3'H蛋白在進(jìn)化上歸屬不同的分支，EpF3'H與非洲菊雜交種、菊花的F3'H親緣關(guān)系較近，處于同一分支上。蛋白質(zhì)多序列比對(duì)分析顯示，EpF3'H與非洲菊雜交種（DQ218417）、菊花(AB523844)高度同源，相似度分別為83.52%和82.67%，這表明EpF3'H是F3'H家族成員。F3'H可通過(guò)底物競(jìng)爭(zhēng)羥基化二氫黃酮醇3'位，合成紫紅色色素的前體物質(zhì)，EpF3'H可能與其他F3'H蛋白一樣具有相同的催化功能。

圖1 EpF3'H與其他植物F3'H蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

通過(guò)NCBI保守基序的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，EpF3'H蛋白功能結(jié)構(gòu)域（細(xì)胞色素P450結(jié)構(gòu)域）有四個(gè)特有保守基序和三個(gè)F3'H特有保守基序，表明EpF3'H是典型的F3'H蛋白。

2.3 EpF3'H的基因表達(dá)

RT-PCR結(jié)果（圖2）顯示，EpF3'H在松果菊的葉和花中均有不同程度的表達(dá)。EpF3'H在S4花期中表達(dá)量最高，其他時(shí)期表達(dá)量從高到低依次為S2、S1、S3和葉?？梢?jiàn)，EpF3'H的表達(dá)模式大致與花青素積累模式相對(duì)應(yīng)。

圖2 EpF3'H基因相對(duì)表達(dá)量

3 結(jié)論

研究表明，EpF3'H參與了松果菊花色形成，也發(fā)揮了類似于F3'H在擬南芥等物種中的功能[6]，可決定無(wú)色二氫黃酮醇的羥化位置和程度，從而合成不同種類花青素苷。