秦妍，包永睿，2，王帥，2，李天嬌，2，張秀君，孟憲生，2*（. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連6600；2. 遼寧省中藥多維分析專(zhuān)業(yè)創(chuàng)新技術(shù)中心，遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 6600；. 丹東藥業(yè)集團(tuán)有限公司，遼寧 丹東 80）

肝病一直以來(lái)都是全球面臨的公共問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題，包括脂肪性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等[1]。目前，世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明[2]，全球約有2.4億慢性乙肝病毒攜帶者和1.5 億慢性丙肝病毒感染者。其中，慢性乙型肝炎患者中有10%～20%進(jìn)展為肝硬化；2020年，全球肝癌發(fā)病人數(shù)高達(dá)90.5677 萬(wàn)人，因肝癌死亡人數(shù)為83.0180 萬(wàn)人。肝病發(fā)病原因眾多，氧化應(yīng)激毒性、膽汁酸異常代謝、噬肝性病毒、miRNA 調(diào)控可能是造成肝臟疾病主要危險(xiǎn)因素[3]。除此之外，酒精、肥胖、遺傳因素、飲食狀況等也與肝病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前，臨床上治療肝病的抗病毒藥物層出不窮，其機(jī)制主要為抑制病毒的復(fù)制。但對(duì)于肝硬化、原發(fā)性肝癌患者，更多的治療手段也難以控制疾病的進(jìn)程，因此迫切需要尋找毒副作用低、安全有效的治療藥物。

山豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根莖，始載于《開(kāi)寶本草》，《植物名實(shí)圖考》中記載，山豆根解毒功熱甚效，與臨床消熱解毒的效用一致[4]。山豆根具有多種不同生物活性成分，包括生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、酶、核苷酸和微生物等。山豆根具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、保肝、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、改善心血管系統(tǒng)等[5-9]。體內(nèi)外試驗(yàn)研究表明，山豆根及其主要活性成分在治療肝癌、抑制新生血管生成、保護(hù)肝損傷方面發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用微流控芯片技術(shù)始終保持給藥持續(xù)性，更加接近人體真實(shí)環(huán)境。靜態(tài)培養(yǎng)易出現(xiàn)藥物蓄積等情況，而微流控芯片采用低剪切力灌注不會(huì)因藥物蓄積而影響藥物釋放，因而也避免了因侵襲作用結(jié)果不準(zhǔn)確的問(wèn)題。酶聯(lián)免疫吸附法將抗原抗體親和反應(yīng)的高度特異性與酶催化反應(yīng)的放大作用相結(jié)合，在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)顏色反應(yīng)來(lái)進(jìn)行定量分析，操作簡(jiǎn)單方便、靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果相對(duì)可靠。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，從山豆根中提取的山豆根生物堿能不同程度地減少肝組織中VEGF、PI3K mRNA 的表達(dá)，增加PTEN mRNA 的表達(dá)，其作用機(jī)制與環(huán)磷酰胺相似[10]。然而由于山豆根活性成分的多樣和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以獲得山豆根保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。因此本研究首先通過(guò)中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，預(yù)測(cè)山豆根抗肝炎、肝硬化、肝癌的潛在藥效物質(zhì)。進(jìn)一步采用微流控芯片技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為山豆根保肝作用的相關(guān)靶點(diǎn)及機(jī)制闡述提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

槲皮素（批號(hào)：100081-201509，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；山柰酚（批號(hào)：JOT-10193）、異鼠李素（批號(hào)：JOT-10450）（成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；脂多糖（批號(hào)：HY-D1056，Sigma公司）。0.1%結(jié)晶紫染色液（北京索萊寶科技有限公司）；冰醋酸（批號(hào)：20181123，分析純，天津科密歐有限公司）；Corning Matrigel 基質(zhì)膠（批號(hào)：6235004，美國(guó)Gibco 有限公司）；胎牛血清（批號(hào)：S0901A，美侖生物技術(shù)有限公司）；腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA試劑盒（批號(hào)：KE00068，Proteintech 公司）；白介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA 試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0015c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞株

人正常肝細(xì)胞（L-02）、小鼠肝星形細(xì)胞（HSC-T6）、人肝癌細(xì)胞（HepG-2）[賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司]。

1.3 儀器

SUNRISE 酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）；NIKON ECLIPSE TI 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；JKG-2A 型光刻機(jī)（上海學(xué)澤光學(xué)機(jī)械有限公司）；HPDC32G2 型等離子清洗機(jī)（美國(guó)Harrick Plasma 公司）；KW-4A 型勻膠機(jī)（昆山力電精密機(jī)械有限公司）；LSP04-1A 精密注射泵（保定蘭格公司）。

2 方法

2.1 藥理學(xué)研究

2.1.1 山豆根有效化學(xué)成分與靶點(diǎn)的收集 在TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索山豆根的有效化學(xué)成分及成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，篩選條件為口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18，根據(jù)篩選所得的山豆根活性成分獲取所對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)，利用UniProt（https：//www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo sapiens”，收集山豆根活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的基因名。

2.1.2 疾病靶點(diǎn)的收集 利用GeneCards（https：//www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫(kù)（相關(guān)性評(píng)分≥1.0）、DrugBank（https：//www.drugbank.com） 數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd） 數(shù) 據(jù) 庫(kù)、OMIM（https：//omim.org）數(shù)據(jù)庫(kù)、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org）數(shù)據(jù)庫(kù)，以“cirrhosis”“chronic hepatitis” “l(fā)iver cancer”作為檢索詞分別檢索。合并去除重復(fù)基因后，收集相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.1.3 山豆根“化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將山豆根化學(xué)成分與靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中，利用R 語(yǔ)言獲取山豆根和肝病的共同靶點(diǎn)，同時(shí)構(gòu)建“山豆根-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 基于細(xì)胞侵襲特征的微流控芯片構(gòu)建 采用CorelDraw X7 矢量制圖軟件進(jìn)行芯片設(shè)計(jì)，結(jié)合高分辨率打印機(jī)以膠印的方式輸出至透明菲林片上制成掩膜。

2.2.2 脂多糖誘導(dǎo)L-02 細(xì)胞損傷模型的制備 將細(xì)胞隨機(jī)分為0（空白對(duì)照組）、5、10、15、20、25 mg·L-1的脂多糖組，每孔5 個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞基本完全貼壁后，加入不同質(zhì)量濃度的脂多糖，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、6、9、12、24、48 h，用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活情況，確定肝損傷模型。

2.2.3 體外侵襲藥效學(xué)評(píng)價(jià) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將基質(zhì)膠與無(wú)血清的DMEM 混勻后緩慢注入芯片上層通道內(nèi)，待基質(zhì)膠固化后將脂多糖處理的L-02 肝損傷模型[11]、HSC-T6、HepG-2 分別接種于上層通道內(nèi)，并在芯片下層通入含有2%FBS的DMEM 培養(yǎng)液，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后，借助蠕動(dòng)注射泵以0.1 μL·min-1的速度對(duì)上層通道通入含藥培養(yǎng)液，以1 μL·h-1的速度對(duì)下層通入含有10%FBS 的細(xì)胞培養(yǎng)液。

給藥干預(yù)24 h 后，分離兩層通道層，取出微孔濾膜放置12 孔板中，使用0.1%的結(jié)晶紫染色液對(duì)微孔濾膜進(jìn)行浸泡染色15 min；使用生理鹽水洗掉多余染料后，置于培養(yǎng)箱內(nèi)烘干；烘干后在各個(gè)孔內(nèi)加入1.5 mL 33%的醋酸，置于搖床上進(jìn)行脫色處理，10 min 后收集洗脫液，借助酶標(biāo)儀在570 nm 下讀取OD值，以空白組的OD值為參照，計(jì)算相對(duì)侵襲率。相對(duì)侵襲率（%）＝（OD給藥/OD空白）×100%。

2.2.4 ELISA 法檢測(cè)上清中TNF-α及IL-6 水平

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-02、HSC-T6、HepG-2細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，加入終濃度為0、150、200、250 μmol·L-1的槲皮素、山柰酚、異鼠李素培養(yǎng)24 h 后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)TNF-α和IL-6 水平。

2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 山豆根藥理學(xué)研究結(jié)果

3.1.1 山豆根活性成分收集結(jié)果 共得到山豆根的活性成分21 個(gè)。去除無(wú)靶點(diǎn)的成分共得到山豆根活性成分10 個(gè)，主要包括黃酮類(lèi)化合物（如槲皮素、山柰酚）、生物堿類(lèi)（如槐果堿、槐醇）、異黃酮類(lèi)（如芒柄花素），以及酮類(lèi)（如異鼠李素）。這些主要的活性有效成分均有不同程度的抗炎、抗腫瘤作用。

3.1.2 肝病潛在靶點(diǎn)的收集 GeneCard 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到與肝炎、肝硬化、肝腫瘤關(guān)聯(lián)基因12 450個(gè)，DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到105 個(gè)，TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到130 個(gè)，OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到167個(gè)關(guān)聯(lián)基因以及 PharmGkb 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到320個(gè)相關(guān)基因，刪除共有的基因，共得到12 648 個(gè)疾病關(guān)聯(lián)基因。

3.1.3 山豆根-活性成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將收集的174 個(gè)山豆根潛在靶點(diǎn)與肝癌的12 646 個(gè)潛在靶點(diǎn)相匹配，得到山豆根和肝病的共同靶點(diǎn)（170個(gè)），將山豆根藥材與其所含有效活性成分及靶點(diǎn)相互對(duì)應(yīng)，并運(yùn)用 Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建相互關(guān)系，見(jiàn)圖1，其中槲皮素富集的靶點(diǎn)最多。

圖1 山豆根-活性成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig 1 Network construction of active components in Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma

3.2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 構(gòu)建細(xì)胞侵襲特征的微流控芯片 本實(shí)驗(yàn)所用芯片設(shè)計(jì)為四層，呈現(xiàn)中心對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)圖及實(shí)物圖見(jiàn)圖2。該芯片從下至上依次是玻璃基底層、流體通道層B、三層微孔濾膜層以及流體通道層A，三層微孔濾膜結(jié)構(gòu)單元通過(guò)靜電吸附作用鍵合在一起，PDMS 層通過(guò)熱鍵合處理，實(shí)現(xiàn)可逆封接，以便后續(xù)去除固定，并且每層都有獨(dú)立的藥液入口及廢液口。

圖2 細(xì)胞侵襲特征微流控芯片設(shè)計(jì)圖及實(shí)物圖Fig 2 Design drawing and physical drawing of microfluidic chip with cell invasion characteristics

3.2.2 脂多糖處理的L-02 肝損傷模型的建立 由圖3可知，脂多糖對(duì)肝細(xì)胞活力的影響具有劑量依賴(lài)性；脂多糖作用24 h，其存活率接近線性變化；但時(shí)間超過(guò)24 h，各組細(xì)胞增殖活力均下降。15、20、25 mg·L-1脂多糖作用12、24、48 h條件下，除15 mg·mL-1作用12 h 細(xì)胞存活率降低不明顯，各組均可明顯降低肝細(xì)胞活力。質(zhì)量濃度為20 mg·L-1，作用24 h 時(shí)，其存活率為50.66%，從存活曲線來(lái)看，選擇接近線性變化的中間劑量20 mg·L-1脂多糖，作用24 h 作為致肝損傷造模劑量[12]。

圖3 不同質(zhì)量濃度脂多糖對(duì)各組肝細(xì)胞存活率的影響Fig 3 Effect of different concentrations of lipopolysaccharide on the survival rate of hepatocytes in each group

3.2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 不同質(zhì)量濃度藥效單體干預(yù)下的細(xì)胞侵襲活性結(jié)果見(jiàn)圖4。與空白對(duì)照組相比，3 種藥效單體均能顯著抑制細(xì)胞侵襲，呈劑量依賴(lài)性，特別是槲皮素（6 μg·mL-1）和異鼠李素（6 μg·mL-1）抑制HepG-2 細(xì)胞侵襲作用明顯。

圖4 槲皮素（A）、山柰酚（B）、異鼠李素（C）對(duì)L-02 肝損傷模型及HSC-T6、HepG-2 細(xì)胞的相對(duì)侵襲率Fig 4 Relative invasion rate of quercetin（A），kaempferol（B）and isorhamnetin（C）on L-02 liver injury model，HSC-T6 and HepG-2 cells

3.2.4 ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6 水平有所降低，中、高濃度組最為明顯，僅有槲皮素中濃度組對(duì)HSC-T6 的IL-6 的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，另外槲皮素、山柰酚、異鼠李素（200、250 μmol·L-1）組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 L-02 肝損傷模型及HSC-T6、HepG-2 細(xì)胞ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1 ELISA of L-02 liver injury model，HSC-T6 and HepG-2 cell invasion

4 討論

肝臟疾病的治療與預(yù)防一直以來(lái)都是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題，肝臟不僅參與代謝、消化，在維持機(jī)體平衡方面也具有至關(guān)重要的作用?！奥愿窝?肝硬化-肝癌”是公認(rèn)的肝臟疾病三部曲，抑制疾病的發(fā)展進(jìn)程將可能避免肝癌的發(fā)生。

本研究利用“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析了山豆根藥效物質(zhì)，進(jìn)一步明確化學(xué)成分與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。其中，藥理網(wǎng)絡(luò)中排名前三位的化學(xué)成分依次為槲皮素、山柰酚、異鼠李素，均為黃酮類(lèi)。槲皮素具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗細(xì)胞凋亡等多種藥理作用[13]。Lu 等[14]研究顯示，槲皮素可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路，下調(diào)MMP-2 和MMP-9D 的表達(dá)，進(jìn)而抑制重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HC-CLM3 細(xì)胞的遷移和侵襲。Liu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可顯著降低血清轉(zhuǎn)氨酶和總膽汁酸水平，減少促炎因子及IL-6 的釋放，通過(guò)降低氧化應(yīng)激、減輕炎癥，發(fā)揮對(duì)肝臟潛在的保護(hù)作用。山柰酚是多種植物性食品中一類(lèi)主要膳食黃酮，日常食用富含山柰酚的食物能夠降低肝癌、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、下調(diào)上皮-間質(zhì)相關(guān)信號(hào)，調(diào)節(jié)PI3K-PKB 信號(hào)通路而發(fā)揮作用[16]。異鼠李素可以顯著阻止四氯化碳（CCl4）或膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化，降低磷酸化Smad 蛋白（Smad3）、減少細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的形成及自噬、抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而預(yù)防肝纖維化[17]。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示了山豆根的藥效物質(zhì)，其可通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)靶點(diǎn)共同作用實(shí)現(xiàn)保肝護(hù)肝作用。結(jié)合微流控芯片技術(shù)及體外ELISA 實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果，對(duì)于下一步分子機(jī)制研究具有重要的意義。