吳玉潔, 陳瑤瑤, 王堅(jiān)毅,3*

(1.廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué) 生命與科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣西 南寧 530004;3.廣西大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 廣西 南寧 530004)

0 引言

癌癥是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。黃酮類化合物具有廣泛的生物活性,很多黃酮類化合物都因其在腫瘤治療中的安全性與療效而受到醫(yī)藥研究者的關(guān)注[1]。山奈酚可以溫和地抑制細(xì)胞生存能力,也可以顯著降低 MRNA 的VEGF基因表達(dá)和卵巢癌細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)水平,濃度為20 μmol/L山奈酚處理 OVCAR-3 細(xì)胞24 h后可以有效減少了VEGF的分泌,證明山奈酚可以抑制OVCAR-3誘導(dǎo)的血管生成和腫瘤生長(zhǎng)[2]。Lin等[3]的實(shí)驗(yàn)表明,濃度為5～50 μmol/L的菊花素以濃度和時(shí)間依賴性方式降低細(xì)胞活力。徐鑒等[4]的研究表明,在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),黃酮類衍生物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。黃元政等[5]通過拼合原理設(shè)計(jì)并合成對(duì)2 型糖尿病具有作用的新型黃酮衍生物。Krisztina等[6]通過Buchwald-Hartwig胺化反應(yīng),設(shè)計(jì)并合成黃酮-氨基酸雜合物,其中化合物12c在抗T淋巴細(xì)胞白血病(CCRF-CEM)中的細(xì)胞毒性為9.2 μmol/L。文獻(xiàn)[7]研究表明,富含芹菜素的飲食可以降低女性患乳腺癌與男性患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn),芹菜素可以抑制腫瘤生長(zhǎng)并顯著延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。薛穩(wěn)來等[8]對(duì)高良姜進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,在山柰素-4′-甲醚的3位羥基引入適當(dāng)修飾,得到可以抑制K562增殖的黃酮衍生物。Deng等[9]對(duì)3′,4′,5′-三甲氧基黃酮類化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行了深入研究。2016年,設(shè)計(jì)并合成一系列含有三甲氧基苯的黃酮類水楊酸酯衍生物和一系列白楊素水楊酸酯衍生物用作抗腫瘤劑,用腫瘤細(xì)胞MCF-7、HepG2、MGC-803和小鼠腫瘤細(xì)胞 MFC評(píng)估了化合物的抗增殖活性。其中,化合物7g對(duì) MGC-803 細(xì)胞和 MFC 細(xì)胞顯示出最有效的抗增殖活性,IC50分別為(11.05 ± 1.58)、(13.73 ± 2.04)μmol/L；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,7g導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G0/G1期,并以劑量依賴性方式誘導(dǎo)MFC細(xì)胞凋亡。此外,化合物7g在體內(nèi)顯示出良好的抗腫瘤活性。2017年,Wang等[10]設(shè)計(jì)并合成一系列3′,4′,5′-三甲氧基黃酮類苯并咪唑衍生物,并評(píng)估了它們對(duì) MGC-803、MCF-7、HepG-2 和 MFC 腫瘤細(xì)胞系的抗增殖活性,化合物15在體外表現(xiàn)出最突出的抗增殖活性,IC50值分別為(20.47±2.07)、(43.42 ± 3.56)、(35.45 ± 2.03)、(23.47 ± 3.59)μmol/L。此外,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了化合物15抑制的初步機(jī)制,揭示該化合物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性。2018年,Deng等[11]初步評(píng)估一系列3′,4′,5′-三甲氧基黃酮類水楊酸衍生物作為抗腫瘤劑。Bian等[12]以漢黃芩為原料,通過取代反應(yīng)在A環(huán)連接了雜環(huán)化合物,并研究這些化合物在體外對(duì)HepG2、A549和BCG-823等癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性活性,其中化合物3h對(duì)HepG2、A549和BCG-823的抑制活性最高,IC50分別為1.07、1.74、0.98 μmol/L。設(shè)計(jì)、合成并成功投放于市場(chǎng)的高效、低毒的抗癌藥物一直都是科研工作者努力奮斗的目標(biāo)。通過文獻(xiàn)查閱,發(fā)現(xiàn)黃酮類衍生的生物活性廣泛且療效比較好,此基礎(chǔ)上,筆者對(duì)黃酮類化合物在抗癌方面做出繼續(xù)研究,保留黃酮骨架結(jié)構(gòu),通過對(duì)二氯芐連接氨基脲類,作為抗癌小分子藥物,希望能得到活性較好的小分子藥物。通過初步的生物活性測(cè)試,確定化合物W2有望成為抗癌藥物的先導(dǎo)。

將藥效團(tuán)進(jìn)行組合從而設(shè)計(jì)出具有雙功能或者多功能靶向的小分子是近幾十年來藥物設(shè)計(jì)的一種較為有效的策略。通過查閱文獻(xiàn)資料了解到黃酮類衍生物具有廣泛的生物活性,抗腫瘤活性是其中的一個(gè)值得科研工作者關(guān)注與探索的活性之一。

1 材料與方法

1.1 原料

苯甲酰氯(上海麥克林生化科技有限公司);4-氟苯甲酰氯、4-甲氧基苯甲酰氯(上海賢鼎生物科技有限公司);4-氯苯甲酰氯[薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司]；1,4-對(duì)二氯芐(上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司)；鹽酸氨基脲(廣東翁江化學(xué)試劑有限公司)；硫代氨基脲(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),不經(jīng)純化直接使用。

1.2 化合物的合成方法

本文黃酮衍生物合成如圖1所示。從圖中可見,保留了黃酮主要骨架,通過對(duì)二氯芐連接氨基脲小分子,并在此基礎(chǔ)上變換B環(huán)上4′的取代基團(tuán),探索不同取代基對(duì)化合物抗癌活性的影響；或者是保留黃酮骨架及4′的取代基團(tuán)不變,變換尾部連接的氨基脲或氨基硫脲,探索不同脲對(duì)化合物的抗癌活性的影響。黃酮類化合物的溶解性需要一定的提升,尾部連接親水小分子,是為了增加黃酮類衍生物的親和力。

反應(yīng)條件:①乙酸酐,三氟化硼乙醚絡(luò)合物,80 ℃,6 h。②苯甲酰,碳酸鉀,四丁基溴化銨,60 ℃,丙酮。③醋酸鈉-醋酸,130 ℃,5 h。④碳酸鉀,室溫,MeOH/CH2Cl2。⑤對(duì)二氯芐,碳酸鉀,80 ℃,乙腈。⑥碳酸鉀,70 ℃,N,N-二甲基甲酰胺/碳酸鉀,60 ℃,丙酮。

1.2.1 化合物1-(2,4-二羥基-3-甲基)苯乙酮(2)的合成

向三氟化硼乙醚絡(luò)合物(BF3·Et2O)(3.0 mL,0.024 mol)的溶液中加入2-甲基苯-1,3-二醇(1.24 g,0.01 mol),將該懸浮液在70℃下攪拌直至形成紅色透明溶液,然后讓該溶液冷卻至室溫,并在1 h內(nèi)將乙酸酐(Ac2O)(1.04 mL,0.011 mol)滴加到該溶液中[13]。滴加完后,將混合物在80 ℃加熱回流6 h,混合物由紅色透明溶液變成橙黃色懸浮液。冷卻至室溫后,加入冰水(100 mL),用乙醚(Et2O)萃取水層。減壓除去Et2O,用MeOH/H2O重結(jié)晶。獲得無色晶體化合物2(1.49 g),產(chǎn)率為90%。

1.2.2 中間體6(a-d)的合成

以7(4-(氯甲基)芐基)氧基-8-甲基-2-苯基-4氫-色原酮6a的合成為例[13-14]。

將2(1 g,6.02 mmol),K2CO3(4.99 g,36.11 mmol),苯甲酰氯(1.72 mL,15.04 mmol)和50 mL丙酮的混合物在回流下攪拌8 h,然后除去溶劑。加水(50 mL),并用鹽酸將溶液調(diào)節(jié)至pH=4左右,得到黃色固體β-二酮。然后將所得的β-二酮3a在NaOAc/HOAc(8 g，40 mL)的條件下回流、攪拌5 h,冷卻至室溫。加水,過濾,將所得的物質(zhì)和無水K2CO3放入混合物(MeOH與CH2Cl2的體積比為1∶1)于室溫下攪拌12 h。分離純化,得到所需化合物5a,為白色晶體,產(chǎn)率為75%。

分別稱取5a(0.5 g,1.98 mmol),K2CO3(1.10 g,7.93 mmol),1,4-對(duì)二芐氯(0.38 g,2.18 mmol)和15 mL乙腈,讓混合物在80℃下回流攪拌8 h,待反應(yīng)完,冷卻至室溫,加水?dāng)嚢? h左右,過濾,將濾餅分離純化得到0.65 g目標(biāo)化合物6a,為米白色固體,產(chǎn)率為83.90%。

1.2.3 目標(biāo)化合物W1、W2、W3、W4的合成

稱取化合物6(a-e)(1 mmol), 鹽酸氨基脲(1.1 mmol),無水K2CO3(2.05 mmol),并加入到50 mL的燒瓶中,以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑,在70 ℃下加熱攪拌,經(jīng)過TLC監(jiān)測(cè),待目標(biāo)產(chǎn)物點(diǎn)不再變化,冷卻至室溫,加入冷水進(jìn)行充分?jǐn)嚢?過濾,最后以MeOH與CH2Cl2體積比為1∶35的洗脫劑進(jìn)行洗脫,分離純化得到目標(biāo)化合物W1、W2、W3、W4。

1.2.4 目標(biāo)化合物W5的合成

將6b(0.15 g,0.37 mmol),硫代氨基脲(56.17 mg,0.44 mmol),無水K2CO3(0.20 g , 1.47 mmol)加入到燒瓶中,以丙酮為溶劑,在60℃下加熱回流,經(jīng)過TLC監(jiān)測(cè),待目標(biāo)產(chǎn)物點(diǎn)不再變化,冷卻至室溫,加入冷水進(jìn)行充分?jǐn)嚢?過濾,純化得到目標(biāo)化合物W5。

1.3 目標(biāo)化合物的譜圖及數(shù)據(jù)

1.3.1 目標(biāo)化合物W1

白色固體,產(chǎn)率27.76%。

1H NMR(500 MHz, DMSO-d6),δ:8.09(ddd,J=5.9, 3.0, 1.2 Hz, 2H), 7.89(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.63～7.57(m, 3H), 7.46(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.37(d,J=7.9 Hz, 2H), 7.31(d,J=8.9 Hz, 1H), 6.96(d,J=1.0 Hz, 1H), 5.30(s, 2H), 5.21(t,J=5.7 Hz, 1H), 4.52(d,J=5.7 Hz, 2H), 2.42(s, 3H)。

13C NMR(150 MHz, DMSO)；δ:177.41, 162.65, 160.71, 160.43, 155.15, 135.65, 132.15, 131.98, 129.69, 129.34, 127.91, 126.68, 123.88, 117.79, 114.39, 111.14, 106.77, 70.46, 55.62, 8.94。ESI-MS: 計(jì)算值為[C25H24N3O4]+430.17, 實(shí)驗(yàn)值為[M+H]+430.18, m.p.170.0～172.5 ℃。

1.3.2 目標(biāo)化合物W2

米黃色固體,產(chǎn)率31.37%。

1H NMR(500 MHz, DMSO-d6),δ:8.19～8.14(m, 2H), 7.89(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.48～7.41(m, 4H), 7.37(d,J=7.9 Hz, 2H), 7.31(d,J=8.9 Hz, 1H), 6.96(s, 1H), 5.30(s, 2H), 5.20(t,J=5.7 Hz, 1H), 4.52(d,J=5.7 Hz, 2H), 2.42(s, 3H)。

13C NMR(150 MHz, DMSO-d6),δ:177.34, 165.51, 163.53, 161.71, 160.70, 155.10, 142.94, 135.32, 129.38, 129.31, 128.54, 127.96, 127.09, 126.69, 123.84, 117.68, 116.86, 116.69, 114.38, 111.18, 106.70, 70.53, 63.18, 8.93。ESI-MS: 計(jì)算值為[C25H23FN3O4]+448.16, 實(shí)驗(yàn)值為[M+H]+448.17, m.p.181.5～184.0 ℃。

1.3.3 目標(biāo)化合物W3

米黃色固體,產(chǎn)率25.31%。

1H NMR(500 MHz, DMSO-d6),δ:8.15～8.10(m, 2H), 7.90(dd,J=8.9, 2.7 Hz, 1H), 7.69～7.65(m, 2H), 7.46(dd,J=8.1, 1.9 Hz, 2H), 7.37(d,J=7.8 Hz, 2H), 7.32(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.00(s, 1H), 5.31(s, 2H), 5.20(t,J=5.7 Hz, 1H), 4.52(d,J=5.7 Hz, 2H), 2.43(s,J=6.6 Hz, 3H)。

13C NMR(150MHz, DMSO),δ:177.33, 161.51, 160.76, 155.10, 142.95, 136.90, 135.31, 130.88, 129.76, 128.53, 127.97, 127.09, 123.87, 117.74, 114.41, 111.27, 107.13, 70.54, 63.12, 8.95。ESI-MS: 計(jì)算值為[C25H22ClN3O4Na]+486.13, 實(shí)驗(yàn)值為[M+Na]+486.12, m.p.153.0～155.0 ℃。

1.3.4 目標(biāo)化合物W4

淺黃色固體,產(chǎn)率21.48%。

1H NMR(500 MHz, DMSO-d6),δ:8.07～8.03(m, 2H), 7.88(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.46(d,J=8.1 Hz, 2H), 7.37(d,J=7.9 Hz, 2H), 7.29(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.17～7.13(m, 2H), 6.86(s, 1H), 5.30(s, 2H), 5.20(t,J=5.7 Hz, 1H), 4.52(d,J=5.7 Hz, 2H), 3.86(s, 3H), 2.42(s, 3H)。

13C NMR(150 MHz, DMSO),δ:177.27, 162.72, 162.48, 160.55, 155.06, 142.92, 135.37, 128.50, 127.94, 127.09, 124.12, 123.78, 117.75, 115.13, 114.29, 111.00, 105.28, 70.50, 63.13, 55.99, 8.93。ESI-MS: 計(jì)算值為[C26H26N3O5]+460.18, 實(shí)驗(yàn)值為[M+H]+460.19, m.p.187.5～190.0 ℃。

1.3.5 目標(biāo)化合物W5

淺黃色固體,產(chǎn)率19.64%。

1H NMR(500 MHz, DMSO-d6),δ:8.20～8.15(m, 2H), 7.89(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.48～7.42(m, 4H), 7.37(d,J=7.8 Hz, 2H), 7.31(d,J=8.9 Hz, 1H), 6.96(s, 1H), 5.30(s, 2H), 5.20(t,J=5.7 Hz, 1H), 4.52(d,J=5.7 Hz, 2H), 2.42(s, 3H)。

13C NMR(126 MHz, DMSO),δ:177.35, 165.52, 161.74, 160.71, 155.12, 142.94, 135.32, 129.40, 129.33, 128.54, 127.96, 127.10, 123.85, 117.68, 116.88, 116.70, 114.39, 111.21, 106.71, 70.53, 63.12, 8.94。ESI-MS: 計(jì)算值為[C25H23FN3O3S]+464.18,實(shí)驗(yàn)值為[M+H]+464.19, m.p.128.5～131.0 ℃。

2 活性測(cè)試

2.1 MTT檢測(cè)小分子藥物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

將細(xì)胞A549(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)種植在96孔板上,每孔加入150 μL含有細(xì)胞濃度1×104mL-1的培養(yǎng)基,在37℃、體積濃度為5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h；在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行觀察,待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng),棄去舊的培養(yǎng)基后,向每個(gè)孔里加入不同濃度(5個(gè)濃度梯度)的藥物(每組3個(gè)復(fù)孔),同時(shí)設(shè)置空白組和對(duì)照組；培養(yǎng)48 h后,加入15 μL配制好的MTT溶液(質(zhì)量濃度為5 mg/mL),在37 ℃、體積濃度為5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育4 h；棄去上清液,每孔加150 μL的DMSO,在振蕩機(jī)上避光振蕩10 min；使用多功能酶標(biāo)儀對(duì)96孔板上各個(gè)孔板進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)它們?cè)?90 nm波長(zhǎng)下的光密度(OD)值,并且根據(jù)公式計(jì)算每個(gè)藥物對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

2.2 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

在1 mL PBS中加入1×106個(gè)A549細(xì)胞,混勻,以1 200 r/min的轉(zhuǎn)速離心分離5 min,去上清液；每管加入100 μL 1×Binding Buffer,重懸,再加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD；將溶液輕輕地振蕩后,室溫(25℃)避光孵育15 min；分別加入200 μL 1×Binding Buffer,在1 h內(nèi)上機(jī)。

3 目標(biāo)化合物的活性測(cè)試結(jié)果

MTT檢測(cè)是為了評(píng)估目標(biāo)化合物W1，W2，…，W5對(duì)A549細(xì)胞抗增殖活性,它們的抗增殖活性分別是509.010、15.860、142.500、24.680、120.900 μmol/L。5個(gè)化合物對(duì)A549細(xì)胞都有一定的抗增殖活性,其中W2的活性最好。當(dāng)R1是氨基脲時(shí),黃酮B環(huán)上4′的H被取代后,其抗增殖活性優(yōu)于未取代化合物,且取代基為F時(shí)活性最優(yōu),活性由強(qiáng)到弱順序?yàn)閃2、W4、W3、W1,這或許與取代基的電負(fù)性有關(guān),電負(fù)性由大到小順序是F、O、Cl、H；而W2的抗增殖活性是4′無取代的W1的32倍左右,可能跟F的電負(fù)性大有關(guān)；W2的抗增殖活性是W3的9倍,可能與取代基的原子半徑大小有關(guān),同主族F的原子半徑比Cl的小,取代基原子半徑越小,活性越好。W2的抑制活性比W5好,這可能是因?yàn)樵谄渌麠l件相同的情況下,氨基脲中的O原子比氨基硫脲的S原子更活潑。MTT的結(jié)果表明,黃酮骨架上的4′被吸電子基團(tuán)取代后有利于增強(qiáng)目標(biāo)化合物的抗增殖活性,而化合物W2則是該系列抗癌藥物進(jìn)一步發(fā)展的希望,所以本文選擇了化合物W2進(jìn)行了細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

化合物W2誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡如圖2所示。為了進(jìn)一步驗(yàn)證化合物W2的抗癌活性,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)化合物W2對(duì)A549細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用,不同濃度(0、5、15、25 μmol/L)的化合物W2作用于A549細(xì)胞48 h,與0 μmol/L組相比,5 μmol/L組的細(xì)胞總凋亡率沒有明顯變化(分別為3.36%、3.31%,正常細(xì)胞比例分別為95.7%與94.9%)；而W2濃度為15 μmol/L時(shí),癌細(xì)胞的總凋亡率為5.30%,比0 μmol/L組的凋亡率增加了1.94%,W2濃度為25 μmol/L時(shí),癌細(xì)胞的凋亡率為8.38%,比0 μmol/L組的凋亡率增加了5.02%,可以看出化合物濃度越高細(xì)胞凋亡率越大,細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)與MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符。數(shù)據(jù)表明,W2可以促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡,且呈現(xiàn)劑量依賴性(圖3)。

(a)0 μmol/L

圖3 細(xì)胞凋亡柱狀圖

4 總結(jié)與展望

本文以2-甲基苯-1,3-二醇、乙酸酐、苯甲酰氯、1,4-對(duì)二氯芐等原料經(jīng)過傅克?；⑷〈磻?yīng)、成環(huán)反應(yīng)等步驟合成了一系列新的氨基(硫)脲類黃酮衍生物,并進(jìn)行了MTT實(shí)驗(yàn),所有化合物都對(duì)A549細(xì)胞有一定的抗增殖活性,其中W2活性最優(yōu),其IC50為15.860 μmol/L,并在流式細(xì)胞術(shù)中顯示出促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的作用。這些化合物有望用作設(shè)計(jì)更好生物活性衍生物的新型骨架,為設(shè)計(jì)高效、低毒的新型抗癌的黃酮類衍生物提供一定的幫助。