于曉玥, 馬洪文, 楊永杰, 張建萍, 陸永良*, 唐 偉*

(1. 中國水稻研究所,水稻生物學國家重點實驗室, 杭州 310006; 2. 寧夏農林科學院農作物研究所, 銀川 750105)

近年來,隨著水稻輕減化和機械化種植的發(fā)展和農村勞動力缺失等問題的出現(xiàn),雜草對水稻生產(chǎn)的危害也越來越嚴重。稗Echinochloacrus-galli是禾本科稗屬雜草,是一種在全世界普遍發(fā)生的田間惡性雜草,嚴重影響水稻生產(chǎn)[1-2]。生產(chǎn)上主要通過化學除草劑來防治稗草,目前我國已經(jīng)登記的用于防治稗草的除草劑主要有丁草胺、丙草胺、五氟磺草胺、雙草醚、噁唑酰草胺、氰氟草酯、敵稗、二氯喹啉酸、噁草酮、嘧啶肟草醚等[3]。近年來雜草的抗藥性問題日益嚴重,目前在水稻田中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗藥性雜草涉及的除草劑包括乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,ALS)抑制劑類除草劑,乙酰輔酶A羧化酶(acetyl co-enzyme A carboxylase, ACCase)抑制劑類除草劑和激素類除草劑[4]。

五氟磺草胺屬于ALS抑制劑類除草劑,可以有效防除水稻田中稗草及部分闊葉類雜草及莎草[5]。ALS是植物體內支鏈氨基酸合成途徑的關鍵酶,在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD),硫胺素焦磷酸(TPP),Mg2+等的作用下發(fā)揮催化活性。研究人員通過構建擬南芥ALS蛋白與五氟磺草胺的復合物晶體,發(fā)現(xiàn)五氟磺草胺與ALS酶的特定位點結合時,會激發(fā)ALS酶兩個催化中心的氧原子,釋放O2,使FAD被氧化,并且改變硫胺素焦磷酸的化學結構,導致ALS酶催化反應無法正常進行,造成植株死亡[6];當ALS酶與五氟磺草胺結合位點發(fā)生突變時,五氟磺草胺不能破壞ALS酶的催化反應,突變植株生長不受影響從而表現(xiàn)出抗藥性。目前在雜草中已發(fā)現(xiàn)的ALS類除草劑的抗性突變位點有:Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653和Gly654(根據(jù)擬南芥ALS蛋白的氨基酸編號)[7]。

近年來稗草的抗性問題越來越嚴重,2015年安徽發(fā)現(xiàn)了對五氟磺草胺和氰氟草酯產(chǎn)生抗性的稗草種群[8];2016年寧夏稻區(qū)發(fā)現(xiàn)了多個對五氟磺草胺表現(xiàn)中高抗性水平的稗草種群[9];2017年報道了遼寧和黑龍江地區(qū)的稗草對噁唑酰草胺產(chǎn)生抗性[10];2018年上海發(fā)現(xiàn)了對五氟磺草胺、氰氟草酯和二氯喹啉酸表現(xiàn)抗性的稗草種群[11];2020年廣東發(fā)現(xiàn)對五氟磺草胺,雙草醚和二氯喹啉酸表現(xiàn)抗性的稗草種群[12]。

寧夏是我國主要的水稻生產(chǎn)地,該地區(qū)水稻田的雜草防控主要依賴化學除草劑,近年來由于除草劑的單一使用,在多地發(fā)現(xiàn)了五氟磺草胺的抗性種群,但并未對抗性機理進行深入研究。寧夏稻區(qū)的稗草種類多為稗原變種或無芒稗[13],在前期研究中,我們測定了采自寧夏稻田的12個稗原變種E.crus-gallivar.crus-galli種群對五氟磺草胺的敏感性,有7個種群在田間推薦劑量下的鮮重防效達到95%以上,為敏感種群;有5個種群在5倍田間推薦劑量下的鮮重防效小于50%,為疑似抗性種群。本研究以這5個疑似抗性種群和1個敏感種群為研究對象,明確不同種群對五氟磺草胺的抗性水平并探索其抗性機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究中所采用的稗草種群均為2015年在寧夏采集,于2016年在中國水稻研究所(30.04°N, 119.55°E)網(wǎng)室中用田間推薦劑量的五氟磺草胺處理后,保留存活的植株收種留用,編號及初始采集地信息如表1所示,其中N43為敏感種群,其余為疑似抗性種群。

表1 稗草樣本采集地信息Table 1 Locations of collected Echinochloa crus-galli var. crus-galli populations

1.2 稗草對五氟磺草胺的抗性及馬拉硫磷對其抗性水平的影響

采用整株生物測定法測定不同稗草種群對五氟磺草胺的抗性水平及馬拉硫磷對其抗性的影響。將稗草種子置于鋪有2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,在晝夜溫度為30℃/20℃,光周期L∥D=12 h∥12 h的培養(yǎng)箱中催芽2 d,將萌發(fā)的種子移植于高9 cm，直徑11 cm的含土盆缽中,置于網(wǎng)室內培養(yǎng),生長條件為白天(30±5)℃,夜間(15±5)℃,相對濕度為(80±5)%,光照約14 h。出苗后每盆保留3株長勢相近的植株,待植株生長至3～4葉期噴施不同劑量的待測藥劑,每個處理組包含5個重復。噴施儀器為3WP-2000型行走式噴霧塔(農業(yè)農村部南京農業(yè)機械化研究所),噴液壓力為0.28 MPa,噴液量為450 L/hm2。

稗草對五氟磺草胺抗性測定:選用25 g/L五氟磺草胺可分散油懸浮劑(陶氏益農),施藥劑量為0,1.875,3.75,7.5,15,30,60,120,240 g/hm2(有效成分劑量,下同),施藥后14 d取稗草植株地上部分稱重。

馬拉硫磷對五氟磺草胺毒力的影響:預試驗表明單獨噴施1 000 g/hm2的馬拉硫磷對稗草的生長沒有顯著影響。將1 000 g/hm2的馬拉硫磷噴施在所有待測植株上,1 h后噴施不同劑量的五氟磺草胺,劑量設置同上,施藥后14 d取稗草植株地上部分稱重。

參考Chen等[14]的方法,采用R軟件,根據(jù)非線性回歸公式y(tǒng)=d/[1+(x/GR50)b]計算藥劑對稗草種群的GR50,其中y為處理組稗草相對于對照組稗草鮮重的百分比,d為相對鮮重的上限,x為除草劑劑量,GR50為相對鮮重為50%時的除草劑劑量,b為斜率。以GR50最低的種群為敏感種群(S),根據(jù)其他種群與敏感種群GR50的比值(RI)判定抗性水平,RI≥10.0為高抗種群(HR),5.0

1.3 稗草ALS基因的擴增與序列比對

取3～4葉期的稗草葉片組織0.5 g,液氮速凍并研磨,按照新型植物基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)的操作步驟提取基因組DNA,每個種群選取5個單株樣本進行基因組提取。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的稗草ALS基因(GenBank登錄號 KY071206.1)序列設計能夠包含所有已知突變位點的上下游引物,引物信息見表2。PCR反應體系如下:LaTaq(5 U/μL)0.5 μL,GC buffer 25 μL,dNTPs 8 μL,10 μmol/L上、下游引物各 1 μL,模板 1 μL,加水定容至50 μL。反應條件如下:95℃ 預變性 5 min;95℃變性 30 s,53℃ 退火30 s,72℃延伸 100 s,35個循環(huán);72℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,將純化后的PCR產(chǎn)物送杭州尚亞測序公司測序。根據(jù)測序結果的色譜圖,對其中出現(xiàn)雙峰的樣本進行TA克隆測序。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化回收,將目的條帶連接到pMD19-T載體,每個樣本至少測定8個陽性轉化子插入片段的DNA序列,測序結果使用BioEdit software 7.2.5軟件進行序列比對。

表2 用于稗草ALS基因擴增的引物信息1)Table 2 Information of primers for amplification of ALS gene from Echinochloa crus-galli var. crus-galli

1.4 稗草種群ALS酶離體活性測定

待測稗草種群生長至3～5葉期時,稱取3 g新鮮葉片組織,液氮速凍保存,稗草種群ALS酶的提取方法與離體活性的測定參考Yu等的方法[15]。98%五氟磺草胺原藥(Aladdin)溶于丙酮溶液中,配制成濃度為10 mol/L的母液,在200 μL的ALS粗酶液中加入100 μL的五氟磺草胺稀釋溶液及400 μL的ALS酶反應液 (5 mmol/L氯化鎂,100 mmol/L丙酮酸鈉,1 mmol/L硫胺素焦磷酸,0.01 mmol/L黃素腺嘌呤二核苷酸的磷酸緩沖液，pH 7.5),五氟磺草胺的終濃度為0.01,0.1,1,10,102,103,104,105,106nmol/L,對照組為等體積的丙酮溶液,每個處理組和對照組包含3個重復,然后進行ALS酶的離體活性顯色反應,反應結束后在525 nm 測定吸光度。以98%的3-羥基-2-丁酮標準品(Aladdin)為底物,建立3-羥基-2-丁酮的標準曲線[y=3.706 7x+0.004 3,R2=0.980 5,其中x為3-羥基-2-丁酮濃度 (nmol/L),y為吸光度]；用考馬斯亮藍法測定粗酶液的蛋白濃度,計算得到不同處理條件下反應液中3-羥基-2-丁酮的含量(nmol/mg protein),以此計算對ALS酶的抑制中濃度(IC50),計算公式y(tǒng)=c+{ (d-c)/[1+(x/IC50)b]},其中y為處理組乙偶姻含量相對于對照組乙偶姻含量的百分比,c為相對含量的下限,d為相對含量的上限,b為斜率,x為五氟磺草胺濃度,IC50為3-羥基-2-丁酮相對含量為50%時的五氟磺草胺濃度。每個種群包含3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 整株法測定稗草種群對五氟磺草胺的抗性倍數(shù)

采用整株生物測定法測定了五氟磺草胺對6個稗草種群的GR50,結果如表3所示。5個疑似抗性種群對五氟磺草胺均表現(xiàn)出不同水平的抗性,五氟磺草胺對種群N14,N22,N51,N53 的GR50相對于敏感種群(N43)的GR50(3.59 g/hm2)而言,已經(jīng)達到高抗水平(抗性倍數(shù)10.18倍～32.71倍),種群N27相對于敏感種群為低抗水平(4.20倍)。

表3 五氟磺草胺對稗草種群的GR50及稗草的抗性水平1)Table 3 GR50 values of penoxsulam and resistance indices of Echinochloa crus-galli var. crus-galli populations to penoxsulam

2.2 抗性種群的靶標基因ALS的克隆與序列分析

利用PCR技術擴增6個種群的ALS基因,PCR產(chǎn)物的測序結果顯示,稗草種群N14,N22,N27和N51的序列色譜圖顯示編碼第574位氨基酸(根據(jù)擬南芥ALS蛋白序列編號)的密碼子呈現(xiàn)雙峰,存在TGG和TTG兩種形式,即574位氨基酸存在色氨酸(Trp)和亮氨酸(Leu),為574位突變雜合子;種群N53的序列色譜圖顯示編碼第197位氨基酸的密碼子呈現(xiàn)雙峰,存在CCC和CTC兩種形式,即197位氨基酸存在脯氨酸(Pro)和亮氨酸(Leu),為197位突變雜合子。從每個種群中隨機選擇5個單株進行測序,結果顯示同種群的5個單株突變類型一致,表明抗性種群的純度較高。敏感種群N43的ALS基因在197位和574位氨基酸的密碼子均為單峰,編碼的氨基酸分別為Pro和Trp(圖1)。進一步測定各樣本ALS基因的亞克隆轉化子,轉化子中也存在突變和未突變兩種序列,再次證實了上述ALS基因的突變。

圖1 稗草種群ALS基因突變位置的序列色譜圖Fig.1 Sequence chromatograms at the mutation sites of ALS gene in Echinochloa crus-galli var. crus-galli populations

2.3 離體條件下五氟磺草胺對稗草種群ALS酶抑制程度的分析

我們測定了離體條件下ALS酶對五氟磺草胺的敏感性(表4),結果顯示五氟磺草胺對抗性種群ALS酶的抑制程度均小于敏感種群,即抗性種群的IC50大于敏感種群N43,其中高抗種群N14,N22,N51,N53的ALS酶活性的IC50分別是敏感種群的4.20,4.92,3.48,3.88倍,低抗種群N27的ALS酶活性的IC50是敏感種群的2.22倍。這一結果說明抗性種群中的ALS基因突變導致ALS酶對五氟磺草胺的敏感性降低,進而引起種群對五氟磺草胺的抗性反應。

表4 稗草種群乙酰乳酸合酶(ALS)的離體活性1)Table 4 In vitro activity of ALS from Echinochloa crus-galli var. crus-galli populations

2.4 馬拉硫磷對稗草種群敏感性的影響

用P450抑制劑馬拉硫磷和五氟磺草胺共同處理各稗草種群,結果表明在馬拉硫磷作用下，五氟磺草胺對各種群的GR50相比單獨噴施五氟磺草胺的GR50均有不同幅度的降低,其中,N14,N22,N51的抗性倍數(shù)下降到中抗水平(9.23,5.34,7.08倍),N53的抗性倍數(shù)下降到低抗水平(1.63倍),N27的抗性倍數(shù)也降低但依然維持在低抗水平(2.31倍),說明P450抑制劑馬拉硫磷會提高抗性稗草種群對五氟磺草胺的敏感性。

表5 在馬拉硫磷作用下五氟磺草胺對稗草種群的GR50及稗草的抗性水平Table 5 GR50 values of penoxsulam and resistance indices of Echinochloa crus-galli var. crus-galli populations to penoxsulam under the affect of malathion

3 結論與討論

ALS抑制劑類除草劑的藥劑種類豐富,使用范圍廣,但作用位點單一,在全世界多個國家均有抗藥性問題的報道,經(jīng)統(tǒng)計全世界范圍內抗ALS類除草劑的雜草已超過160種,遠遠多于其他作用機制除草劑的抗性雜草種類數(shù)量[7]。在我國水稻田中常見的抗ALS除草劑的雜草包括久雨花Monochoriakorsakowii、野慈姑Sagittariatrifolia、鱧腸Ecliptaprostrata、稗草等[4]。五氟磺草胺是美國陶氏益農公司開發(fā)的三唑嘧啶類化合物,于2008年在我國登記,優(yōu)勢在于殺草譜廣,且對水稻生長安全,因此被廣泛應用于防治水稻田中的惡性雜草。近年來稗草對五氟磺草胺的抗藥性在我國多個地區(qū)均有報道,馬洪文等在寧夏地區(qū)采集了21份稗草種群,通過種子催芽法測定其對五氟磺草胺的抗性水平,結果發(fā)現(xiàn)有12個種群對五氟磺草胺產(chǎn)生不同程度的抗性,這說明寧夏地區(qū)的稗草對五氟磺草胺的確存在較高的抗性水平[9],但對其抗性機制并未進行深入研究。在前期試驗中,我們在寧夏多地采集到了多個稗草種群,用高劑量的五氟磺草胺篩選種群的抗性水平,結果發(fā)現(xiàn)有5個種群為疑似抗性種群。本文采用整株生物測定法測定了它們對五氟磺草胺的GR50,這種方法相比于種子催芽法能更真實準確地反映稗草在成株期對五氟磺草胺的抗性水平。結果表明,在5個疑似抗性稗草種群中,有4個為高抗種群,1個為低抗種群,最高抗性倍數(shù)達到32.71倍。

ALS抑制劑類除草劑根據(jù)化學結構可以分為5類:磺酰脲類、咪唑啉酮類、三唑嘧啶類、嘧啶水楊酸類、磺酰胺三唑啉酮類。以擬南芥的ALS蛋白(AtALS)為例,AtALS由4個亞基組成,每個亞基含有三個結構域:α-domain(氨基酸86-280)、β-domain(氨基酸281-451)、γ-domain(氨基酸463-639),以及一個C末端(648-668)[16]。由于不同化學結構的除草劑與ALS蛋白結合的氨基酸位點存在差異,導致ALS蛋白上不同位點的氨基酸突變造成的抗藥性類型也存在差異。例如,Ala122和Ser653突變會對咪唑啉酮類除草劑產(chǎn)生抗性,而不會對磺酰脲類除草劑產(chǎn)生抗性;Pro197突變會對磺酰脲類除草劑產(chǎn)生抗性,而不易對咪唑啉酮類除草劑產(chǎn)生抗性;Trp574突變會產(chǎn)生對磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑的抗性[16-17]。此外,不同物種的ALS蛋白與同一除草劑結合的氨基酸位點也存在差異,研究人員分別構建了五氟磺草胺與酵母ALS蛋白(ScALS)和擬南芥ALS蛋白(AtALS)的晶體復合物,結果發(fā)現(xiàn)有部分氨基酸結合位點是保守的,如Phe206,Arg377,Met570,Val571,Trp574(根據(jù)擬南芥的氨基酸編號),但是有些氨基酸結合位點在兩個蛋白中存在差異,如AtALS的Arg199,Met200和Ser653可以與五氟磺草胺結合,ScALS的這三個位點并不與五氟磺草胺結合[6]。不同的ALS基因突變位點在雜草中的發(fā)生頻率也是不同的,例如Trp574Leu突變包含38種雜草,Pro197Ser突變包含27種雜草,Pro197Thr突變包含14種雜草。目前還沒有研究證明稗草的ALS蛋白與五氟磺草胺的結合位點有哪些,迄今為止在稗草中已發(fā)現(xiàn)的ALS基因突變包括4個位點的5種突變形式:Ala122Thr,Ala122Gly,Ala205Val,Pro197Ser,Trp574Leu[18-22]。本研究中,分析5個抗性種群的ALS基因序列發(fā)現(xiàn)的突變位點為Pro197Ser和Trp574Leu,同時抗性種群的ALS酶在離體條件下也對五氟磺草胺的敏感性下降,進一步說明抗性種群靶標基因的突變導致靶標酶與五氟磺草胺的親和力下降是導致抗藥性產(chǎn)生的原因,這也是首次在寧夏地區(qū)發(fā)現(xiàn)靶基因突變的抗性稗草種群。值得注意的是,不同突變位點的稗草種群對五氟磺草胺的抗性水平存在差異,例如574位突變的N22的抗性倍數(shù)高于197位突變的N53,這可能由于不同位點與五氟磺草胺結合的親和性不同所導致的;而相同突變位點的稗草種群對五氟磺草胺的抗性水平也存在差異,例如574位突變的N22,N14,N51為高抗種群,而同樣574位突變的N27為低抗種群,這有可能是由于抗性種群代謝五氟磺草胺的能力存在差異,即非靶標抗性機制不同。

非靶標抗性的主要機制包括:細胞色素P450和谷胱甘肽轉移酶GST介導的代謝解毒作用,以及細胞轉運蛋白ABC介導的轉運作用[23]。本研究中,在P450抑制劑馬拉硫磷的作用下,5個種群對五氟磺草胺的抗性表現(xiàn)出不同程度的下降,說明P450酶系介導的代謝抗性也是引起稗草抗性的原因之一。值得注意的是,馬拉硫磷對不同種群抗性水平的影響存在明顯差異,在馬拉硫磷的作用下，五氟磺草胺對N22和N53的 GR50與單獨使用五氟磺草胺處理的GR50相比下降了約95%，而對N14，N27，N51的GR50只下降了79%～83%。馬拉硫磷處理后五氟磺草胺對敏感種群N43的GR50也有一定程度的降低，降低了68%。說明稗草體內的P450酶系在介導五氟磺草胺的代謝方面的能力是不同的。P450酶系在植物體內包含大量基因,P450基因過量表達會導致雜草代謝除草劑的能力增加,例如,CYP81A12 和CYP81A21 在抗雙草醚的稻稗Echinochloaphyllopogon中顯著上調表達,這兩個基因的過表達擬南芥突變體同樣表現(xiàn)出對雙草醚和五氟磺草胺較高的耐受性,證明這兩個基因的確與除草劑的代謝抗性相關[24]。我們推測不同抗性稗草種群在五氟磺草胺刺激條件下,P450基因的表達量存在差異,或者誘導表達的P450基因數(shù)量及功能存在差異,所以導致P450酶系介導的代謝抗性存在差異。另一種推測是,在抗性稗草中GST酶系和ABC轉運蛋白也發(fā)揮了代謝解毒作用,所以只是抑制P450酶并不能完全改變稗草對五氟磺草胺的抗性,這些推測還需要下一步的試驗進行驗證。