魏 昕, 查晴辰, 楊姝祺, 劉豐銀, 趙 林, 鄧建新*

(1. 長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 荊州 434025; 2. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 福州 350028)

油葵HelianthusannuusLinn.是菊科向日葵屬的一年生高大草本植物,為世界第二大油料作物?？ㄗ芽蓧赫コ龅湍懝檀嫉母呒?jí)食用葵花油。由于其中含有66%的亞酸油,被譽(yù)為21世紀(jì)“健康營(yíng)養(yǎng)油”[1]。此外,榨油后剩余的殘?jiān)呛芎玫牡鞍踪|(zhì)飼料。油葵的種植成本低,管理簡(jiǎn)單,產(chǎn)量高,含油量好,抗逆性強(qiáng),已作為特色油料作物被納入我國(guó)重點(diǎn)種植產(chǎn)業(yè)中,目前陜西省已擁有大量油葵示范基地[2-3]。并且,油葵的經(jīng)濟(jì)價(jià)值越來越受重視,市場(chǎng)需求進(jìn)一步提升。然而,在大面積種植油葵時(shí),病害發(fā)生的可能性增高,若防治不當(dāng),會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,所以對(duì)其病害的監(jiān)測(cè)、鑒定、預(yù)防和防治尤為重要。

油葵常見的病害有菌核病、黑斑病、褐斑病、葉枯病、霜霉病等[4]。其中黑斑病在油葵種植區(qū)普遍發(fā)生,主要病原菌為鏈格孢Alternariaspp.,該菌危害花盤、莖和葉等多個(gè)部位,對(duì)油葵產(chǎn)量造成極大損失,一般年減產(chǎn)10%～20%,嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)可達(dá)50%以上,甚至絕收[5]。目前世界上已報(bào)道與向日葵黑斑病相關(guān)的鏈格孢共有11種,為鏈格孢Alternariaalternata、紅花鏈格孢A.cathami、向日葵鏈格孢A.helianthi、侵染向日葵鏈格孢A.helianthinficiens、A.heliophytonis、白花菊鏈格孢A.leucanthemi、A.protenta、A.roseogrisea、細(xì)極鏈格孢A.tenuissima、瘤鏈格孢A.tuberculata和百日菊鏈格孢A.zinniae。中國(guó)已報(bào)道的有7種,包括A.alternata、A.helianthi、A.helianthinficiens、A.leucanthemi、A.tenuissima、A.tuberculata和A.zinniae,其中向日葵鏈格孢A.helianthi為優(yōu)勢(shì)種[6]。向日葵鏈格孢首次由Hansford于1943年在烏干達(dá)發(fā)現(xiàn),并命名為Helminthosporiumhelianthi[7],1969年Tubaki將其更名為A.helianthi[8]。目前世界各地,如印度、日本、中國(guó)、美國(guó)等國(guó)均有報(bào)道[9]。

本研究從陜西省華陰市油葵葉片黑斑病樣品上分離純化得到病原菌菌株,檢測(cè)其致病性,并從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征進(jìn)行鑒定,明確其種類及分類地位,為向日葵黑斑病病原菌的分類研究及防治提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌種來源

2017年9月于陜西省華陰市采集油葵葉斑病病害樣本,切取病健交界處組織,利用保濕培養(yǎng)的方法進(jìn)行單孢分離[10]。將純化后的菌種編號(hào)并保存于長(zhǎng)江大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。致病性檢測(cè)后,選取YZU 171766和YZU 171770進(jìn)行后續(xù)研究。

1.1.2培養(yǎng)基

PDA:馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,Difco,USA)24 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL。

PCA: 馬鈴薯20 g,胡蘿卜20 g,蒸餾水1 000 mL。

1. 2 試驗(yàn)方法

1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài):供試菌株在PDA上培養(yǎng)3～5 d后,在菌落邊緣取3個(gè)菌齡一致的菌絲塊接種于直徑90 mm的PDA培養(yǎng)基上(呈正三角分布),在25℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d,描述菌落形狀,顏色等,并測(cè)量菌落直徑。

孢子形態(tài):取少量菌絲接種于PCA上,在22℃,L∥D=8 h∥16h的條件下培養(yǎng)7 d[11]后觀察產(chǎn)孢表型和分生孢子形態(tài)等,并隨機(jī)選取50個(gè)分生孢子進(jìn)行測(cè)量。

1.2.2分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

供試菌株在PDA上培養(yǎng)5～7 d后,刮取適量菌絲體至1.5 mL離心管中適當(dāng)研磨,然后采用改良CTAB法提取DNA[12]。以提取的DNA為模板,對(duì)供試菌株YZU 171766和YZU 171770的ITS (ITS5/ITS4)[13]和LSU(LROR/LR5)[14]基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用25 μL的反應(yīng)體系,含2×TaqPCR StarMix(北京擎科生物科技有限公司)21 μL,DNA模板2 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s,(ITS: 55℃;LSU: 50℃)復(fù)性1 min,72℃延伸1 min,32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用含有1%核酸染料(Golden View,北京博邁德基因技術(shù)有限公司)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),將目的條帶產(chǎn)物進(jìn)行正反引物測(cè)序(北京擎科生物科技有限公司)。

利用BioEdit軟件對(duì)測(cè)序成功的序列進(jìn)行校對(duì)，獲得完整序列。登錄NCBI網(wǎng)站利用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)分析,找出相似性最高的菌株,在GenBank數(shù)據(jù)庫或參考文獻(xiàn)中選取模式菌株或代表菌株作為參考(基因登錄號(hào)見表1),確保所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的準(zhǔn)確性。利用jPHYDIT[15]軟件對(duì)所選參考序列與本研究序列進(jìn)行比對(duì),并在MEGA 7.0[16]軟件中對(duì)兩個(gè)基因序列進(jìn)行拼接合并,最后利用RAxML[17]軟件進(jìn)行最大似然法分析(maximum likelihood:ML)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,利用GTRCAT模型計(jì)算1 000次分析獲得bootstrap支持率(BP)。

1.2.3致病性檢測(cè)

供試菌株在PCA上產(chǎn)生分生孢子后,利用無菌水洗脫分生孢子,過濾離心,再配制成濃度為5×105個(gè)/mL的孢子懸浮液。取20 μL的孢子懸浮液滴于干凈健康的油葵葉片中心(株齡30～60 d,株高30～40 cm),以無菌水作為對(duì)照,置于保濕裝置中培養(yǎng),每天觀察并記錄發(fā)病情況,每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。對(duì)發(fā)病部位的病原菌進(jìn)行再次分離,并與原分離物進(jìn)行比對(duì),完成科赫式法則驗(yàn)證。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 油葵黑斑病危害癥狀及致病性檢測(cè)

油葵黑斑病可危害向日葵多個(gè)部位,主要以葉片為主,從下部葉片開始發(fā)病并逐漸向上部蔓延。受害葉片常見圓形或不規(guī)則的黑褐色病斑,病斑周圍常伴有亮黃色暈圈,條件適宜時(shí)病害發(fā)展迅速,后期病斑連成大片導(dǎo)致整個(gè)葉片枯萎死亡(圖1a)。該病也可發(fā)生在葉片和葉柄相連部位,直接導(dǎo)致葉片枯萎,最終脫落。

將供試菌株的分生孢子懸浮液接種于健康的油葵葉片后,第3天接種部位出現(xiàn)褐色的小斑點(diǎn),隨后逐漸擴(kuò)大,病斑呈黑褐色圓斑,中央呈灰白色,邊緣有少量黃色暈圈,接種點(diǎn)略有皺縮,與田間發(fā)病癥狀一致。7 d后測(cè)量病斑直徑,菌株YZU 171766所致病斑直徑一般為8.5～16.5 mm,少數(shù)可達(dá)20 mm,菌株YZU 171770病斑直徑8.0～13.5 mm。兩菌株所致癥狀相似(圖1),YZU 171766引起癥狀略顯嚴(yán)重。從葉片發(fā)病部位分離獲得的病原與原接種物一致,表明分離物為油葵黑斑病病原菌。

圖1 油葵黑斑病田間癥狀及致病性檢測(cè)Fig.1 Symptom of black spots on Helianthus annuus in the field and pathogenicity tests

2.2 形態(tài)學(xué)

兩株病原菌YZU 171766和YZU 171770菌落生長(zhǎng)均緩慢,菌落直徑較小,產(chǎn)孢量較為豐富,而菌落形態(tài)和孢子形態(tài)略有不同，其中YZU 171766的菌落生長(zhǎng)速度較快,分生孢子較短。

菌落形態(tài):在PDA上培養(yǎng)7 d,菌株YZU 171766(圖2a)菌落白色,氣生菌絲毛氈狀,培養(yǎng)基表面形成致密的菌落,中央突起,向外延伸，扁平,邊緣不規(guī)則,背面顏色偏灰白,直徑15～16 mm。菌株YZU 171770(圖2e)菌落呈灰色,在培養(yǎng)基表面形成致密的菌落并結(jié)塊,質(zhì)地偏硬,難以戳破,中央突起,周圍扁平,反面深灰色偏深綠色,邊緣白色,菌落直徑5～6 mm。

孢子形態(tài):在PCA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d,分生孢子梗單生,直立或略彎,淺黃褐色近無色,分隔,基部略微膨大。菌株YZU 171766分生孢子梗(15～75)μm×(5～9)μm,有0～3個(gè)隔膜(圖2b,c);菌株YZU 171770分生孢子梗(20～44)μm×(5～9)μm,有0～4個(gè)隔膜(圖2f, g)。分生孢子單生或鏈生兩個(gè)孢子,直立或稍微彎曲,圓柱狀、長(zhǎng)橢圓形,初期無色,后顏色逐漸成淡黃褐色,兩端鈍圓且無喙,有隔處略微縊縮,有明顯的臍點(diǎn)。菌株YZU 171766分生孢子(29～119)μm×(8～31)μm,有3～10個(gè)橫隔膜,0～3個(gè)縱斜隔膜(圖2d)。菌株YZU 171770分生孢子(42～179)μm×(14～37)μm，有3～12個(gè)橫隔膜,0～4個(gè)縱隔膜(圖2h)。

圖2 向日葵擬鏈格孢菌株YZU 171766和YZU 171770的菌落和分生孢子形態(tài)特征Fig.2 Colonies and conidial morphology of Alternariaster helianthi YZU 171766 and YZU 171770

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

供試菌株YZU 171766和YZU 171770的ITS和LSU基因序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行同源性比對(duì)后發(fā)現(xiàn),其與已報(bào)道的向日葵擬鏈格孢Alternariasterhelianthi(曾用名:向日葵鏈格孢Alternariahelianthi)的一致性均達(dá)99%以上。將ITS和LSU基因序列拼接合并后總共有1 120個(gè)堿基(ITS含547個(gè),LSU含573個(gè))。借助GenBank數(shù)據(jù)庫和參考文獻(xiàn)選取31個(gè)相關(guān)菌株(分別來自5個(gè)不同的科)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(表1),最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3,節(jié)點(diǎn)處顯示最大似然法分析支持率(BP)≥60%的數(shù)據(jù)。

表1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的菌株信息及GenBank登錄號(hào)Table 1 Strains and their GenBank accession no. used in the phylogenetic analysis

續(xù)表1 Table 1(Continued)

在構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹中,供試菌株YZU 171766和YZU 171770與向日葵擬鏈格孢Alternariasterhelianthi聚為一簇(BP=99%),其中YZU 171770與CBS 134018等5個(gè)菌株形成一個(gè)聚類分支(BP=68%), 而YZU 171766呈現(xiàn)在不同的分支上。通過比對(duì),兩個(gè)菌株的LSU基因序列完全相同,ITS基因序列有2個(gè)堿基不同。通過5個(gè)相關(guān)的科(小球腔菌科Leptosphaeriaceae、盾殼霉科Coniothyriaceae、葫蘆霉科Cucurbitariaceae、亞隔孢殼科Didymellaceae、格孢腔菌科Pleosporaceae)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示擬鏈格孢屬Alternariaster屬于小球腔菌科,不屬于格孢腔菌科。擬鏈格孢屬的3個(gè)種Alternariasterhelianthi、Al.bidentis和Al.centaureae-diffusae聚于一支,BP為100%。其中Al.helianthi和Al.bidentis的親緣關(guān)系更近,聚為一支(BP=99%)。而與Al.helianthi形態(tài)相似的白花菊鏈格孢Alternarialeucanthemi與鏈格孢Alternariaalternata聚為一支(BP=100%),屬于格孢腔菌科的鏈格孢屬Alternaria,與小球腔菌科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

2003年,張?zhí)煊钤凇吨袊?guó)真菌志:鏈格孢屬》中對(duì)向日葵鏈格孢Alternariahelianthi進(jìn)行了詳細(xì)的描述[19]。該菌與白花菊鏈格孢Alternarialeucanthemi同為向日葵的重要病原菌,形態(tài)學(xué)上較為相似,可形成單生,直立,無喙,蠕蟲狀的分生孢子,孢子橫徑和橫隔膜數(shù)作為其區(qū)分依據(jù)[19]。白花菊鏈格孢的寄主有馬蘭Asterindicus[6]、大濱菊Leucanthemummaximum[11]和向日葵[18-19],分生孢子長(zhǎng)度<100(～120)μm,橫徑<25 μm,橫隔膜數(shù)最多可達(dá)17個(gè)(表2)。向日葵擬鏈格孢的寄主只有向日葵,分生孢子長(zhǎng)度最大可達(dá)179 μm,橫徑可達(dá)41 μm,橫隔膜數(shù)最多可達(dá)12個(gè)(表2)。由此可見,向日葵擬鏈格孢與白花菊鏈格孢相比,其分生孢子主橫隔少、鮮見增厚,孢身較長(zhǎng),橫徑較寬,且孢壁顏色更淡。然而,它們形態(tài)和產(chǎn)孢表型都與Alternaria的其他種有較大差別,其分類地位一直以來都未引起人們的重視,張?zhí)煊畹萚20]建議應(yīng)將二者獨(dú)立為新屬。2007年Simmons對(duì)鏈格孢屬的形態(tài)學(xué)進(jìn)行詳細(xì)系統(tǒng)的分類研究后,發(fā)現(xiàn)向日葵鏈格孢菌中不存在像鏈格孢菌中常見的顯著且顏色較深的環(huán)痕(分生孢子梗產(chǎn)孢細(xì)胞的產(chǎn)孢孔和分生孢子基部細(xì)胞的著生點(diǎn)),并置于新屬擬鏈格孢屬Alternariaster,更名為Alternariasterhelianthi[11]。本研究利用形態(tài)學(xué)將所分離的油葵黑斑病病原菌鑒定為向日葵擬鏈格孢Alternariasterhelianthi。

基于ITS和LSU基因序列分析,向日葵擬鏈格孢與鏈格孢屬的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。鏈格孢屬真菌屬于子囊菌的格孢腔菌科,而向日葵擬鏈格孢屬于小球腔菌科。此結(jié)果進(jìn)一步從分子系統(tǒng)學(xué)上證明了Simmons[11]形態(tài)學(xué)結(jié)果,原稱為向日葵鏈格孢Alternariahelianthi應(yīng)屬于擬鏈格孢屬Alternariaster真菌,為Al.helianthi的曾用名。本研究結(jié)果與Alves等[18]和Woudenberg等[21]的結(jié)果一致。由于缺乏參考菌株,且形態(tài)學(xué)重要可區(qū)分特征認(rèn)識(shí)不足,小球腔菌科Leptosphaeriaceae的分類研究一直存在一定的問題[20]。Alves等[18]于2013年首次報(bào)道Alternariaster屬的另一個(gè)新種Al.bidentis,分生孢子孢身較短(50～98 μm),橫徑較窄(<20 μm),容易與Al.helianthi區(qū)分開來。此外,Al.bidentis的分生孢子沒有斜或縱隔膜,在菌落上可觀察到性孢子器(spermogonia),而Al.helianthi沒有這些現(xiàn)象。至此,Alternariaster屬共包含兩個(gè)種Al.helianthi和Al.bidentis,且均未觀察到有性態(tài)特征。隨后,Ariyawansa等[22]在矢車菊Centaureadiffusa枯死的莖上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有性態(tài)新種Al.centaureae-diffusae,但未觀察到其無性態(tài)特征。到目前為止Alternariaster屬共包含上述3個(gè)種類。向日葵鏈格孢Alternariahelianthi國(guó)際上雖已更名為Alternariasterhelianthi,但我國(guó)仍在延續(xù)使用前者,為了避免造成國(guó)內(nèi)后期分類混亂,本研究中從形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)兩方面對(duì)其進(jìn)行分析研究,將該菌命名為向日葵擬鏈格孢Alternariasterhelianthi,以期在未來能科學(xué)地統(tǒng)一起來。

圖3 基于ITS和LSU基因序列利用最大似然法構(gòu)建的油葵黑斑病病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the pathogenic fungus causing black spots on Helianthus annuus based on ITS and LSU gene sequences using maximum likelihood

我國(guó)對(duì)向日葵黑斑病的研究主要集中在20世紀(jì)80年代,近十年來,國(guó)內(nèi)外對(duì)油葵黑斑病的研究報(bào)道極少,2014年我國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)向日葵黑斑病病原菌大部分是Alternariaalternata,而未發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)種Alternariasterhelianthi[23]。可見,向日葵黑斑病的優(yōu)勢(shì)病原可能發(fā)生變化,急需進(jìn)行多方面的調(diào)查研究[24]。然而,由于其菌落生長(zhǎng)速度緩慢,在組織培養(yǎng)中很容易被其他生長(zhǎng)速度快的真菌覆蓋(如Alternariaalternata),而不容易被觀察到,建議使用保濕培養(yǎng)的方法進(jìn)行觀察和分離[10]。此外,本研究結(jié)果表明在形態(tài)學(xué)上Alternariasterhelianthi種內(nèi)存在一定的差異性。菌株YZU171766在菌落大小、顏色和分生孢子長(zhǎng)寬均與YZU 171770不同,然而兩株菌對(duì)油葵的致病力差異不大,該結(jié)果為向日葵黑斑病的病原學(xué)和防控等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。