趙 霞, 秦發(fā)亮, 劉文文, 王錫鋒

(中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

灰飛虱Laodelphaxstriatellus(small brown planthopper, SBPH)屬于半翅目Hemiptera飛虱科Delphacidae,是一種刺吸式口器害蟲,其寄主范圍廣泛,主要為害水稻、麥類、稗草等禾本科植物[1]?；绎w虱除了刺吸植物韌皮部汁液對作物造成直接傷害外,其作為一種重要的介體昆蟲還能傳播多種植物病毒,如水稻條紋病毒rice stripe tenuivirus(RSV)和黑條矮縮病毒rice black-streaked dwarf virus(RBSDV)等。在冬季,灰飛虱的若蟲可取食小麥、大麥等作物及部分禾本科雜草。春季,灰飛虱將病毒傳播到水稻或玉米上,導致水稻和玉米等的病毒病害大面積暴發(fā)流行,所造成的損失遠大于直接刺吸為害[2]?；绎w虱以持久增殖的方式傳播RSV,并且病毒還可以經(jīng)卵傳播給下一代。為了深入解析灰飛虱的傳毒機制,本實驗室前期利用RSV的核衣殼蛋白為誘餌篩選灰飛虱cDNA文庫后獲得了灰飛虱的囊泡相關(guān)膜蛋白相關(guān)蛋白B(vesicle-associated membrane protein-associated protein, VAP-B),抑制該蛋白的表達可顯著影響灰飛虱的傳毒率,可見VAP-B在灰飛虱傳播RSV中起了非常關(guān)鍵的作用。

VAP-B是囊泡相關(guān)膜蛋白相關(guān)蛋白家族成員,這類蛋白是高度保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白[3-6]。第一個VAP蛋白(VAP-33)是以SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)家族的囊泡相關(guān)膜蛋白(vesicle-associated membrane protein,VAMP)為誘餌,通過酵母雙雜交試驗在加州海兔Aplysiacalifornica中篩選到的,注射對VAP-33有特異性的抗體會抑制加州海兔的突觸傳遞,這表明VAP-33是神經(jīng)遞質(zhì)胞吐作用所必需的[7]。隨后又在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了VAP-A、VAP-B和VAP-C。VAP-A與VAP-B有較高的序列同源性(63%),且由3個保守的結(jié)構(gòu)域組成:N端的精子主蛋白(major sperm protein, MSP),中間的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain, CCD)和C端的跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TMD)[8]。VAP類蛋白除主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上分布外,在高爾基體和細胞膜等細胞器上也有發(fā)現(xiàn),并可以通過與其他蛋白互作來參與膜轉(zhuǎn)運[9]、脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運和代謝[10-12]，以及未折疊蛋白的反應(yīng)等[13-14]。目前與VAP互作的蛋白主要分為3大類:一類是SNARE家族蛋白,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)SNARE家族蛋白Rbet1和Rsec22可以與VAP-A互作,參與膜融合過程[15-16]。第二類是含有FFAT(double phenylalanine in an acidic tract)基序的蛋白,這類蛋白包含一段EFFDAxE蛋白序列。最早發(fā)現(xiàn)具有這一結(jié)構(gòu)的磷脂生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Opi1p蛋白可以與酵母體內(nèi)的VAP同源物Scs2p互作[17],隨后又發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)結(jié)合蛋白、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白等通過FFAT基序與VAP互作后參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運輸[18-20]。第三類是病毒蛋白,相關(guān)研究表明丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A和NS5B通過與VAP的互作,參與了該病毒的復制過程[21-22]。番茄黃化曲葉病毒tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)的衣殼蛋白通過與介體煙粉虱腸道內(nèi)的VAP-B互作,參與了煙粉虱對TYLCV的傳播[23]?？梢?VAP在生物體內(nèi)具有非常重要的作用。

鑒于VAP-B在真核生物體內(nèi)的保守性和重要作用,本研究克隆了灰飛虱編碼VAP-B的基因,優(yōu)化條件利用原核系統(tǒng)成功表達了可溶蛋白,并將蛋白純化后免疫新西蘭雄兔制備了多克隆抗體,該抗體可以成功應(yīng)用到灰飛虱VAP-B的Western blot和免疫熒光檢測,為研究VAP-B在灰飛虱體內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1灰飛虱

灰飛虱為本實驗室長期保存種群,飼養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中(L∥D=14 h∥10 h,25～27℃),水稻品種為‘黃金晴’,7 d更換1次水稻苗。

1.1.2載體和菌株

pEASY-T5載體及大腸桿菌EscherichiacoliTrans1-T1、Rosetta(DE3)購自全式金生物公司;蛋白提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;表達載體pCOLD-SUMO購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.3試劑

TRIzol購自南京諾唯贊公司;反轉(zhuǎn)錄試劑購自美國Promega公司;rTaq酶購自TaKaRa公司;膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自天漠生物公司;限制酶和T4連接酶購自NEB公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計

本實驗室前期獲得的VAP-B蛋白基因全長750 bp,根據(jù)該序列設(shè)計一對含酶切位點的引物,上游引物酶切位點選擇SacI,上游引物SacI-VAP-B-F: 5′-CGACCTCGATGGCGAATAAACAAGAACA-3′;下游引物酶切位點選擇XbaI,下游引物XbaI-VAP-B: 5′-GCTCTAGAGCTCAGAGCATGTACTTGCCC-3′。

1.2.2目的基因克隆

TRIzol法提取灰飛虱總RNA,然后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以該cDNA為模板,利用含酶切位點的引物通過rTaq酶擴增VAP-B基因,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并將擴增的片段進行膠回收純化。將純化的VAP-B基因片段連接到pEASY-T5載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1,挑取單克隆,送華大公司進行測序驗證。

1.2.3原核表達載體的構(gòu)建

以測序正確的pEASY-T5-VAP-B載體為模板,利用含酶切位點的引物進行片段擴增后再通過膠回收進行純化,純化后的PCR產(chǎn)物和pCOLD-SUMO質(zhì)粒利用SacI和XbaI進行雙酶切,條件為37℃,4 h,然后再利用T4 DNA連接酶4℃連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1,挑取單克隆后提取質(zhì)粒,將質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)入表達菌株Rosetta (DE3)感受態(tài)中,同時轉(zhuǎn)化pCOLD-SUMO空質(zhì)粒作為對照。

1.2.4蛋白VAP-B的原核誘導表達

突出監(jiān)管和服務(wù)“兩個重點”。昆明市局制定 60多項規(guī)范執(zhí)法制度，獲證企業(yè)年度監(jiān)督檢查覆蓋面達100%，2013年以來查處“四品一械”違法案件8396宗，罰沒3441萬元。此外，還開展了一系列專項整治行動，在全國較早出臺《餐廚廢棄物處置辦法》，禁止餐飲服務(wù)單位使用散裝油，實施米線“禁裸令”，形成“昆明經(jīng)驗”。2013年以來辦理行政許可近萬件，審批時限壓縮50%～70%，實現(xiàn)零超時、零投訴、零復議。全力服務(wù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，轄區(qū)內(nèi)兩家連鎖藥店成為全國十強。

挑取含有pCOLD-SUMO-VAP-B的Rosetta (DE3)單克隆,置于1 mL含有50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min培養(yǎng)過夜。取200 μL菌液于50 mL LB培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)使其OD600達到0.6～0.9,然后加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG,16℃,180 r/min培養(yǎng)過夜。另取200 μL的菌液完成上述操作，但不利用IPTG進行誘導,16℃,180 r/min培養(yǎng)過夜。同理,取一個含有pCOLD-SUMO空質(zhì)粒的Rosetta (DE3)單克隆進行上述處理。然后,分別取1 mL上述菌液,12 000 r/min離心棄上清, 400 μL PBS重懸菌液后加5×loading buffer煮沸10 min,12 000 r/min離心后取上清經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍染色分析蛋白的表達情況。剩余的經(jīng)IPTG處理的含有pCOLD-SUMO-VAP-B的Rosetta (DE3)菌液收集菌體后重懸于20 mL PBS緩沖液中,超聲破碎(破碎5 s,暫停5 s,破碎10 min)后12 000 r/min離心20 min將上清與沉淀分離。

1.2.5VAP-B的純化和標簽的去除

利用Ni2+-NTA親和層析柱進行蛋白純化,先將1.2.4獲得的上清液過柱,然后依次利用20 mL PBS、20 mL含40 mmol/L咪唑的PBS、20 mL含80 mmol/L咪唑的PBS洗去雜蛋白,最后利用10 mL含600 mmol/L咪唑的PBS洗脫蛋白。洗脫后的蛋白利用rTEV酶處理去除SUMO標簽,得到純化的無標簽的VAP-B蛋白。

1.2.6抗血清的制備及檢測

選擇月齡3個月的新西蘭雄兔進行多克隆抗體的制備。初次免疫采用皮下多點注射法,為更好地刺激其免疫反應(yīng),利用弗氏完全佐劑將純化的VAP-B蛋白乳化。第11天采用大腿肌肉注射法再次進行免疫,采用弗氏不完全佐劑乳化純化的VAP-B蛋白。以后每周再免疫1次。每次免疫后的第5天取少量血分離血清,利用間接ELISA測定抗體的效價,當效價達到1∶100 000時,利用股動脈采血法采血并收集血清。最后采用protein A-Sepharose affinity column從血清中純化抗VAP-B的IgG。

1.2.7Western blot進行抗體特異性分析

提取灰飛虱總蛋白和純化的VAP-B蛋白,利用4%～20%的SDS-PAGE膠進行凝膠電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,利用含5%奶粉的TBST緩沖液常溫封閉2 h后洗膜3次,每次10 min;然后按照1∶500的比例將VAP-B抗體溶于5%奶粉中,將封閉后的硝酸纖維素膜置于其中,37℃孵育2 h,然后用TBST洗膜3次,每次10 min;再按照1∶2 000的比例孵育二抗(二抗為山羊抗兔IgG),1 h后洗膜,洗3次,每次10 min。最后將其置于發(fā)光成像分析儀(LAS-4000mini)中進行顯色。

顯微鏡下解剖出灰飛虱的唾液腺,用4%的多聚甲醛固定2 h后用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗3次,每次10 min;于2% Triton-100中室溫滲透30 min,PBS中清洗3次,每次10 min;用抗體稀釋液(含有3%牛血清白蛋白的PBS)按照1∶50的比例稀釋一抗anti-VAP-B-IgG。用稀釋后的一抗37℃孵育2 h,PBS中清洗3次,每次10 min;然后再用稀釋后的二抗 anti-rabbit IgG-Cy3(1∶200)孵育 2 h,PBS 中清洗 3 次;最后將唾液腺固定在載玻片上,利用激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 SBPH VAP-B蛋白的誘導表達

PCR獲得VAP-B基因片段,長度為750 bp,膠回收純化后連接到pEASY-T5載體上。

以測序正確的pEASY-T5-VAP-B載體為模板,構(gòu)建原核表達載體pCOLD-SUMO-VAP-B。并轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株Rosetta (DE3)感受態(tài)中,同時轉(zhuǎn)化pCOLD-SUMO空載體作為對照。IPTG誘導表達后,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍染色發(fā)現(xiàn),與對照相比,經(jīng)過IPTG誘導表達的含有pCOLD-SUMO-VAP-B載體的菌液能夠表達出VAP-B的可溶性蛋白,該融合蛋白大小約51 kDa(圖1)。

圖1 VAP-B原核表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of expressed VAP-B in Escherichia coli Rosetta (DE3) after induced by IPTG

2.2 可溶性VAP-B蛋白的純化

將含pCOLD-SVMD-VAP-B的Rosetta (DE3)接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中大量表達VAP-B蛋白,超聲破碎后的上清過Ni2+-NTA親和層析柱進行蛋白純化,先利用PBS和低濃度咪唑洗去雜蛋白,然后利用600 mmol/L的高濃度咪唑?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛?圖2)。再將連接在目的蛋白上的SUMO 標簽去除,最后得到VAP-B無標簽蛋白,該蛋白大小為30 kDa左右(圖3)。

圖2 VAP-B原核表達產(chǎn)物的純化分析Fig.2 Purification analysis of products of VAP-B in Escherichia coli

圖3 切割SUMO標簽后的VAP-B蛋白Fig.3 VAP-B protein after cleaving SUMO tag

2.3 抗血清制備及特異性檢驗

將純化的VAP-B蛋白作為抗原,皮下多點免疫新西蘭雄兔,進行抗體的制備,再利用Western blot分析抗血清的特異性。提取灰飛虱的總蛋白和純化的VAP-B蛋白進行Western blot 檢測。結(jié)果顯示,多克隆抗血清與灰飛虱總蛋白和純化的VAP-B蛋白有特異反應(yīng)(圖4)。

圖4 VAP-B多克隆抗體的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of VAP-B polyclonal antibody

2.4 VAP-B抗體在灰飛虱體內(nèi)標記檢測

解剖灰飛虱的唾液腺,利用免疫熒光法對其進行VAP-B的標記,紅色為利用Cy3標記的唾液腺中的VAP-B,藍色為利用DAPI標記的細胞核。在本研究中,通過激光共聚焦顯微鏡檢測,發(fā)現(xiàn)利用紅色熒光標記的VAP-B抗體可以在灰飛虱唾液腺的不同腺泡內(nèi)定位到該蛋白,對唾液腺進行細胞核染色后發(fā)現(xiàn)VAP-B蛋白主要分布在各個細胞的細胞質(zhì)內(nèi)(圖5)。因此制備的抗體能夠特異性的標記灰飛虱VAP-B,說明該抗體能夠用于免疫熒光分析,可對灰飛虱組織內(nèi)表達的VAP-B進行定位。

圖5 灰飛虱唾液腺VAP-B蛋白定位檢測Fig.5 Distribution of VAP-B in the salivary gland of Laodelphax striatellus by immunofluorescence

3 結(jié)論與討論

抗體制備需要獲得純度較高的可溶性蛋白。原核表達系統(tǒng)尤其是大腸桿菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、生長繁殖快速、成本低廉、外源基因產(chǎn)物水平高等特點[24],因此是最經(jīng)典的、應(yīng)用最廣泛的蛋白表達系統(tǒng)[25]。盡管大腸桿菌在表達膜蛋白的過程中可能會存在豐度低、對細胞有毒性的問題[26],但是經(jīng)過添加融合標簽(如:GST、MBP、SUMO等)、密碼子優(yōu)化、篩選表達宿主等手段,依然有約50%的膜蛋白能在大腸桿菌中成功表達[27-28]。VAP-B是一個膜蛋白,含有一個跨膜區(qū)[29],在本研究中,我們利用大腸桿菌表達系統(tǒng),通過添加融合標簽的方法克服膜蛋白的疏水性,以降低對細胞的傷害。SUMO作為N端載體蛋白可以促進折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,與其余融合標簽相比,提高了蛋白質(zhì)的可溶性[30]。在純化蛋白的過程中,雖然SUMO標簽不像GST和MBP標簽一樣有自己的純化方式,但是其可以通過與6×His標簽連接,經(jīng)過Ni2+-NTA進行純化,獲得高純度的可溶性蛋白。本研究構(gòu)建了原核表達載體pCold-SUMO-VAP-B,使用該載體表達的VAP-B蛋白上融合了SUMO標簽和His標簽,His標簽使得該蛋白可直接通過Ni2+-NTA純化出來,從而獲得重組的VAP-B可溶性蛋白。此外,融合蛋白由于含有SUMO標簽,可能會存在一定的免疫原性,因此需要將SUMO標簽去除。本研究中SUMO標簽與目的蛋白之間含有Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly 7個氨基酸的序列,該序列可以被rTEV酶特異性地識別,從而特異性切割SUMO標簽,使得制備的VAP-B抗體完全不受標簽的影響,增強了抗體的特異性。

本研究獲得的VAP-B抗體不僅能夠用于體外表達純化的VAP-B和灰飛虱VAP-B的Western blot檢測,也可以用于灰飛虱體內(nèi)組織VAP-B的免疫標記。免疫標記技術(shù)的基礎(chǔ)是抗原與抗體之間的特異性反應(yīng),同時結(jié)合標記技術(shù)用以檢測抗原或者抗體,該技術(shù)可以在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上對被檢測蛋白進行定性和定量檢測。研究表明,囊泡相關(guān)膜蛋白相關(guān)蛋白在所有真核細胞中都有表達,且在細胞內(nèi)參與了許多細胞過程的調(diào)節(jié)?；绎w虱是RSV的傳毒介體昆蟲,RSV需要跨越灰飛虱中腸屏障、中腸釋放屏障與唾液腺侵入屏障、唾液腺釋放屏障才能完成水平傳播[31]。在這一過程中,RSV需要通過與介體灰飛虱蛋白的互作完成自身的侵入,運動,復制和擴散等。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),RSV的核衣殼蛋白能夠與介體灰飛虱的VAP-B互作,且VAP-B的mRNA水平在灰飛虱唾液腺中含量最高,本研究制備的抗體可以特異性的在唾液腺內(nèi)標記到VAP-B,這為后期闡明VAP-B在傳毒過程中的關(guān)鍵作用奠定了重要的基礎(chǔ)。