＊文峰 曲潔婷 陳歷鈮 羅霜 閆靜* 蔣雅莉

（1.四川省成都生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心站 四川 610000 2.成都市污染源監(jiān)測中心 四川 610000）

引言

抗生素是一類兼具疾病治療和促進生物體生長代謝功能的化合物，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域[1]，據(jù)統(tǒng)計全球每年抗生素消耗量在10萬噸～20萬噸間，且消耗水平呈逐年上升趨勢。我國作為抗生素生產(chǎn)和消費大國，產(chǎn)量和消費量均居世界首位，僅2013年我國抗生素使用總量就高達16.2萬噸，其中人用和獸用抗生素的比重基本各占50%[2]。研究表明，抗生素水溶性極強同時揮發(fā)性較弱，醫(yī)藥、生活廢水等通過不同途徑進入水環(huán)境后不斷富集于食物鏈、食物網(wǎng)，進而愈發(fā)明顯影響生態(tài)環(huán)境，因此近年來各界越來越關(guān)注地表水抗生素污染狀況。目前國內(nèi)已有對江西錦江河流[3]、貴州赤水河流[4]等地表水抗生素的研究，但成都地區(qū)僅王若男等[5]研究了沱江干流地表水抗生素分布特征，因而此研究確有必要。

試驗選擇成都市人民渠、岷江外江、沙河、府河、南河地表水為研究對象，選擇環(huán)境中檢出率相對較高的6類（四環(huán)素類、氟喹諾酮類、磺胺類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類）12種典型抗生素為分析目標物。從空間分布、季節(jié)變化兩方面闡明成都市地表水典型抗生素分布特征；采用主成分分析結(jié)合多元線性方式對其進行來源解析，探討抗生素主要來源；同時利用風險熵值法進行生態(tài)風險評估。通過實驗研究達到全面了解成都地表水抗生素分布特征的目的，為成都市地表水抗生素污染防治提供科學依據(jù)和參考。

1.實驗部分

(1)儀器與試劑

高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（液相：Thermo UltiMate 3000，質(zhì)譜：ABSCIEX API 4000）；默克Millipore超純水機；微量注射器（1000μL、100μL、10μL）；pH計；分析天平；固相萃取裝置（SUPELCO）；快速氮吹儀；0.22μm濾膜針式過濾器和0.22μm水相濾膜；Waters Oasis HLB小柱（6CC，500mg）。

12種抗生素標準品100mg/L（農(nóng)業(yè)部）：四環(huán)素類（鹽酸四環(huán)素，TC；強力霉素，DOC）、氟喹諾酮類（諾氟沙星，NOR；氧氟沙星，OFL）、磺胺類（磺胺甲噁唑，SMX；磺胺吡啶，SPD；磺胺嘧啶，SDZ）、氯霉素類（氯霉素，CAP）、大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素，ERY；羅紅霉素，RTM）、β-內(nèi)酰胺類抗生素（阿莫西林，AMX；頭孢替安，CTM）。乙腈（HPLC級，Honeywell），乙酸銨（德國Merk），甲酸（德國Merk），甲醇（HPLC級，Honeywell，EDTA二鈉鹽（天津光復），重鉻酸鉀（天津光復），超純水（電阻率18.2MΩ·cm，美國Millipore公司）。

(2)水樣采集與保存

2019-2020年四個季度分別在成都市人民渠、岷江外江、沙河、府河、南河五條河流采集了20個地表水樣品，采樣點位覆蓋成都城、郊地區(qū)，且均位于城市集中污水處理廠上游500m處。

采集前用蒸餾水洗凈棕色玻璃瓶，并浸泡于重鉻酸鉀溶液24h，待超純水沖洗后于250℃烘干2h，冷卻后再以EDTA二鈉鹽甲醇飽和溶液沖洗后采集樣品，每個點位均使用采水器采集水面下0.5m的表層水1L，裝入棕色玻璃瓶，樣品采集后于0～4℃下避光保存，盡快分析。

(3)實驗分析

①儀器條件

Aglient Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1×100mm，2.7μm）；進樣量5μL；柱溫40℃；流速0.4mL/min；流動相為乙腈：2.5mmol乙酸銨&0.1%甲酸水溶液；洗脫方式采用梯度洗脫，洗脫程序見表1；串聯(lián)四極桿質(zhì)譜選擇ESI作為離子源，氯霉素（CAP）在負離子模式下進行分析檢測，其他類化合物均在正離子模式下分析，質(zhì)譜參數(shù)根據(jù)抗生素具體種類進行調(diào)整。

表1 梯度洗脫程序

②水樣處理與分析

將采集水樣經(jīng)0.45μm纖維濾膜過濾去除大顆粒雜質(zhì)后，加入適量Na2EDTA溶液搖勻，并加酸調(diào)節(jié)pH至3左右。先后加入10mL甲醇和純水活化HLB小柱后，取500mL樣品于小柱進行富集，控制流速3～5mL/min，重復一次，富集完成后用10mL超純水淋洗HLB小柱并進行氮吹干燥，干燥后加入10mL甲醇洗脫，收集洗脫液。待洗脫液氮吹濃縮至近干，用甲醇復容至1mL，經(jīng)0.22μm的有機針頭過濾器過濾后移入棕色進樣小瓶，使用LC-MS-MS上機分析。

用甲醇將12種抗生素儲備液配制成1000μg/L的混合標準液，冷藏保存，臨用時以水為溶劑逐級稀釋成濃度分別為：1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L的混合標準液。在上述儀器條件下分別測定各點濃度，采用外標法以響應(yīng)值繪制標準曲線，同時將處理好的樣品直接進樣測定，根據(jù)保留時間和特征離子定性，峰面積定量。

③質(zhì)量控制

看來，這個小胡還真是不簡單。既然這樣，我只能“擒賊先擒王”了。那一整天，我都把小胡“捆”在我身邊。放晚學后，我騎上電動車，載著他去家訪。通過和其父母的交談，我才明白小胡如此“強大”的原因：他家離學校較遠，父親做機械維修，母親在家忙著帶二胎，根本沒時間陪他。為了讓他不受委屈，大方的父親每天送他上學時都要給10至20元零花錢。小胡為人也大方，經(jīng)常買東西給同學，久而久之，大家都聽他的吩咐，加上他本人平時也無心學習，于是便帶出了“白虎隊”。

通過內(nèi)標法完成目標抗生素的定量：線性方程濃度范圍為0.05～100mg/L，且R2值均大于0.99。以3倍信噪比得出待檢測抗生素檢出限為0.01～0.08ng/L；采用平行實驗進行誤差控制，相對標準偏差均小于10%，重現(xiàn)性良好；同時對水樣進行加標回收實驗，各抗生素在水樣中的回收率為72.1%～123.7%，準確性較高。

2.結(jié)果與討論

(1)典型抗生素分布特征

①空間分布特征

成都市5條河流地表水中抗生素普遍存在，6類典型抗生素中僅CAP和CTM未檢出，其他10種抗生素均不同程度檢出且所有目標物檢出率均超過50%，其中NOR、SMX、DOC達到100%檢出。各典型抗生素質(zhì)量濃度水平及檢出率詳見表2，各典型抗生素在成都5條河流地表水中的平均濃度及差異性統(tǒng)計見圖1。

表2 各典型抗生素濃度特征及檢出率（N=20）

圖1 各典型抗生素濃度差異性統(tǒng)計圖

據(jù)表2數(shù)據(jù)及統(tǒng)計圖1可知，氯霉素類抗生素均未檢出，所檢出的5類抗生素質(zhì)量濃度大小依次為：磺胺類、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類。在12種典型抗生素中，磺胺甲惡唑平均檢出濃度最高，達到3118.0ng/L；阿莫西林平均檢出濃度最低，僅為4.6ng/L。根據(jù)研究[6-7]可知，四環(huán)素類抗生素多在沉積物中檢出而β-內(nèi)酰胺類在環(huán)境中極易降解，即使大量使用也極少在水體中檢出，與該研究中兩類抗生素檢出較小質(zhì)量濃度類似。

目前國內(nèi)已有對貴州赤水河、江西錦江等河流地表水抗生素的研究，研究結(jié)果見表3。對比可知成都地表水典型抗生素濃度含量處于中等偏高水平，其中磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類均處于相對較高水平，而β-內(nèi)酰胺類抗生素和氯霉素類則處于較低濃度水平?？傮w研究來看SMX、DOC、RTM三種典型抗生素濃度較高、污染相對嚴重，應(yīng)重點關(guān)注。

表3 國內(nèi)其他城市河流地表水抗生素濃度水平 單位：ng/L

②季節(jié)變化特征

由圖2可知，典型抗生素濃度值總體呈現(xiàn)春季＞夏季＞秋季＞冬季的季節(jié)變化特點，而秋冬季節(jié)整體濃度差異不大。隨著季節(jié)的變化，不同流域單一目標抗生素濃度差異較大，但在10種檢出典型抗生素中磺胺類占比最高，基本都超過50%，其中該類抗生素又以磺胺甲噁唑為主。對于5個采樣點位所在的5條河流而言，沙河、府河點位位于成都城區(qū)，其他點位均位于郊區(qū)，城區(qū)主要以生活排放為主，而郊區(qū)則主要以農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、產(chǎn)物代謝為主，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大量播種的春季典型抗生素濃度含量最高；同時磺胺類作為典型人畜共用類抗生素，極易以原藥或產(chǎn)物代謝的形式進入水環(huán)境中，因此在秋冬枯水季節(jié)中磺胺類濃度值相對較低，進而導致12種典型抗生素濃度值總和最低。

圖2 典型抗生素季節(jié)變化特征

(2)來源解析

根據(jù)不同使用對象可將抗生素分為人用、獸用、人獸共用三大類。磺胺類抗生素是一類人畜共用型抗生素，進入人與動物體內(nèi)不能被完全吸收，以原藥或代謝產(chǎn)物的形式排出體內(nèi)進入水環(huán)境中[10]；ERY、CTM為主要用于人類疾病治療的抗生素[11]；OFL和NOR是國內(nèi)水環(huán)境中檢出頻率和檢出濃度較高的典型喹諾酮類抗生素，其中OFL為人用抗生素，NOR為人畜共用抗生素；四環(huán)素類DOC、TC和氯霉素類CAP是典型的獸用抗生素。

為更精確了解成都地表水典型抗生素類別與來源，選擇檢出率超過50%且平均檢測濃度大于1ng/L的10種典型抗生素采用主成分分析法進行因子分解，見表4。

表4 典型抗生素的主成分矩陣

表4可知，三個主成分解析了成都地表水抗生素93.22%的來源。第一主成分主要為：SMX、SPD、DOC、ERY、RTM，解釋了總方差48.25%，包括2種磺胺類、1種四環(huán)素類和2種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；第二主成分解釋總方差28.20%，主要由氟喹諾酮類和AMX貢獻；第三主成分主要為TC，解釋總方差16.77%。對照前文抗生素來源特征，初步判斷主成分一為人獸共用抗生素、主成分二為人用抗生素、主成分三為獸用抗生素。為更加準確判斷各典型抗生素來源，利用PCA-MLR計算出各成分回歸系數(shù)Bi，再由Bi/∑Bi計算出各源平均貢獻比率[12]，即各來源占比關(guān)系，見式（1）和式（2）。

式中，Bi為方程回歸系數(shù)；FSi為主成分因子得分；Z^為目標抗生素總濃度Z的標準正態(tài)偏差；σ為Z標準差。將因子得分定義為自變量，抗生素總量視為因變量，采用SPSS 23進行多元線性回歸分析可得：Z^=0.825FS1+0.489FS2+0.217FS3，再結(jié)合Bi/∑Bi計算可得出每個源平均貢獻比率。圖3所示，成都地表水典型抗生素中人用、獸用、人獸共用類抗生素占比依次為31.9%、14.2%、53.9%。根據(jù)來源解析結(jié)果可知，人獸共用抗生素使用量較大，占比最高，因此需要更加規(guī)范使用人獸共用類抗生素，同時重點關(guān)注此類抗生素的排放。

圖3 成都地表水典型抗生素來源占比關(guān)系圖

(3)生態(tài)風險評估

風險熵值法（Risk Quotients，RQs）是歐盟指導文件中關(guān)于新型污染物造成生態(tài)環(huán)境風險評價的主要方法，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于水生態(tài)環(huán)境中痕量抗生素暴露劑量產(chǎn)生的生態(tài)風險評估[1]，見式（3）和式（4）。

式中：RQs為風險系數(shù)；MEC為抗生素實測濃度，ng/L；PNEC為預測無效應(yīng)濃度，ng/L，PNEC值通過查閱文獻獲得各目標物急、慢型毒性評估因子（AF）與半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50，ng/L）計算而得?；谧畲笥绊懣紤]，本研究采用各抗生素的最大實測濃度進行RQs值計算，12種典型抗生素生態(tài)風險值詳見表5。為更好評判成都地表水體抗生素生態(tài)風險大小，按Hernando等[13]提出的RQs值進行風險評估，分類標準為：RQs＜0.1為低風險，0.1≤RQs＜1為中風險，RQs≥1為高風險。各抗生素風險等級見圖4。

圖4 典型抗生素生態(tài)風險等級圖

表5 典型抗生素毒理性系數(shù)及風險熵值

續(xù)表

結(jié)合表5抗生素風險熵值和圖4抗生素風險等級可知，成都地表水12種典型抗生素中CAP和CTM完全未檢出，不存在生態(tài)風險，檢出的10種典型抗生素中處于高、中、低風險等級的比例依次為60.0%、30.0%、10.0%。12種典型抗生素中大環(huán)內(nèi)酯類（ERY、RTM）和氟喹諾酮類（NOR、OFL）均對研究區(qū)域水環(huán)境構(gòu)成較重生態(tài)風險，磺胺類與四環(huán)素類部分抗生素也會構(gòu)成一定生態(tài)風險，而β內(nèi)酰胺類在檢測區(qū)域均不存在任何風險。

3.結(jié)論

（1）成都市地表水12種典型抗生素中，除CAP和CTM外均有檢出，SMX平均檢出濃度最高，達到3118.0ng/L，AMX平均檢出濃度最低，僅為4.6ng/L；與已有研究對比可知成都地表水典型抗生素濃度含量處于中等偏高水平，其中SMX、DOC、RTM三種抗生素污染相對較重。

（2）主成分分析結(jié)合多元線性回歸方法對成都地表水典型抗生素進行來源解析，結(jié)果表明人獸共用類抗生素占比最高，達53.9%，因此需要重點關(guān)注此類抗生素使用和排放。

（3）生態(tài)風險熵值表明12種典型抗生素中大環(huán)內(nèi)酯類（ERY、RTM）和氟喹諾酮類（NOR、OFL）均對研究區(qū)域水環(huán)境構(gòu)成較重生態(tài)風險，部分磺胺類與四環(huán)素類抗生素也將構(gòu)成一定生態(tài)風險。

（4）通過本研究可以達到對成都地表水典型抗生素分布特征的全面了解，同時為成都市地表水抗生素污染防治提供科學依據(jù)和參考。