張君超,田秀梅,王 艷,閔國春,靳 曼,陳 年
(1.北京美正生物科技有限公司,北京 102200;2.湖北省孝感市公共檢驗檢測中心,湖北孝感 432000;3.三峽公共檢驗檢測中心,湖北宜昌 443000;4.遼寧省糧食檢驗檢測中心,遼寧沈陽 110032)
中國是花生種植大國,花生年產(chǎn)量從2017 年連續(xù)5 年在1 700 萬t 以上,是全球花生主要產(chǎn)區(qū)。目前國內(nèi)花生仍以榨油和食用為主,花生粕是花生果仁經(jīng)壓榨等方式制油后產(chǎn)生的副產(chǎn)品,由于花生種皮薄、粗纖維含量低,壓榨后的花生粕蛋白質(zhì)含量高且氨基酸種類豐富,可以應用在食品、保健品和飼料中[1-2]。但由于花生粕中精氨酸、賴氨酸和蛋氨酸等氨基酸不平衡和大分子蛋白質(zhì)消化利用率低,以及在貯存過程中極易發(fā)生霉變而產(chǎn)生黃曲霉毒素等原因,影響了花生粕蛋白的廣泛、綜合使用[3-4]。隨著花生粕深加工技術的發(fā)展以及飼用豆粕減量替代行動方案的實施,花生粕近年來在食品和飼料中的應用更為廣泛。
黃曲霉毒素是曲霉屬真菌的次生代謝產(chǎn)物,主要有黃曲霉毒素B1、B2、G1和G24 種,其中AFB1的毒性和致癌性最強,嚴重影響食品和飼料的質(zhì)量安全[5-6]。目前花生粕中黃曲霉毒素B1的檢測方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法、電化學法、酶聯(lián)免疫吸附法、時間分辨熒光免疫層析法、膠體金快速定量法和膠體金定性法等多種方法[7-8]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜等儀器檢測方法的準確度高、穩(wěn)定性好、靈敏度高,已作為法檢方法使用,但儀器設備相對昂貴、對檢測人員的要求高,不適合在食品加工企業(yè)、飼料加工企業(yè)以及花生粕原料貿(mào)易中廣泛應用。而基于免疫學的快速檢測方法因其快速、簡便、成本低的特點,適用于基層用戶現(xiàn)場大批量快速檢測,在基層中應用較為廣泛[9-10]。因此,花生粕中黃曲霉毒素B1含量的快速、準確測定對于食品及飼料質(zhì)量安全控制意義重大。
為在基層檢測中更加準確地檢出花生粕中黃曲霉毒素B1,給予生產(chǎn)及貿(mào)易企業(yè)有效的參考,本實驗在原有商業(yè)化快速檢測產(chǎn)品的基礎上,通過對比不同提取溶劑對花生粕中黃曲霉毒素B1快速檢測結(jié)果的影響,選取了最優(yōu)的提取溶劑用于酶聯(lián)免疫吸附法、熒光/膠體金免疫層析快速定量法等快速檢測方法。本實驗增加了黃曲霉毒素B1的快速檢測商品化產(chǎn)品中花生粕樣本的適用性。
花生粕樣品:來源于油脂生產(chǎn)企業(yè)、花生粕貿(mào)易企業(yè)和飼料加工企業(yè)。
乙腈、甲醇均為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司);黃曲霉毒素B1ELISA 檢測試劑盒、黃曲霉毒素B1熒光快速定量檢測試紙條和黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測試紙條(北京華安麥科生物技術有限公司)。
天平(PL602E,梅特勒-托利多);多管渦旋儀(HMG-WX,北京美正生物科技有限公司);離心機(TG16-W,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);酶標分析儀(HF4500,北京華安麥科生物技術有限公司);熒光定量快速檢測及監(jiān)測分析系統(tǒng)(HYG001,北京華安麥科生物技術有限公司)和膠體金定量快速檢測及監(jiān)測分析系統(tǒng)(HMG001,北京華安麥科生物技術有限公司)。
1.3.1 花生粕中黃曲霉毒素B1檢測方法
①酶聯(lián)免疫法。除提取溶劑外,前處理方法和檢測方法參照黃曲霉毒素B1ELISA 檢測試劑盒(北京華安麥科生物技術有限公司)產(chǎn)品說明書。②熒光/膠體金免疫層析快速定量法。除提取溶劑外,前處理方法和檢測方法參照黃曲霉毒素B1膠體金/熒光快速定量檢測試紙條(北京華安麥科生物技術有限公司)產(chǎn)品說明書。
1.3.2 酶聯(lián)免疫法中不同提取溶劑對花生粕中黃曲霉毒素B1檢測結(jié)果的影響
根據(jù)黃曲霉毒素B1自身理化性質(zhì)、現(xiàn)行的檢測方法常用到的提取溶劑以及商品化快速檢測產(chǎn)品的有機溶劑耐受性,選取60%甲醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水3 種溶劑提取,經(jīng)《飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2 毒素的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(NY/T 2071—2011)定值的花生粕樣本,使用黃曲霉毒素B1ELISA 檢測試劑盒檢測,對比不同提取溶劑對檢測結(jié)果的影響。
1.3.3 熒光/膠體金快速定量免疫層析法中不同提取溶劑對花生粕中黃曲霉毒素B1檢測結(jié)果的影響
根據(jù)黃曲霉毒素自身理化性質(zhì)、現(xiàn)行的檢測方法常用到的提取溶劑以及商品化快速檢測產(chǎn)品的有機溶劑耐受性,選取50%乙醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水3 種溶劑提取,經(jīng)《飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2 毒素的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(NY/T 2071—2011)定值的花生粕樣本,使用黃曲霉毒素B1熒光/膠體金快速定量檢測試紙條檢測,對比不同提取溶劑對檢測結(jié)果的影響。
花生粕經(jīng)60%甲醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水不同提取溶劑提取后使用商品化黃曲霉毒素B1ELISA 檢測試劑盒檢測結(jié)果如表1 所示。結(jié)果顯示,與定值結(jié)果相比,用60%甲醇-水溶劑提取的樣品檢測結(jié)果偏低,回收率在68.1%~78.5%;而用80%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結(jié)果偏高,回收率在120.7%~203.0%;用30%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結(jié)果的回收率在95.1%~109.0%。實驗結(jié)果表明,不同提取溶劑的提取效率有所差異,對于所使用的商品化ELISA 檢測試劑盒來講,其更適合使用30%乙腈-水溶劑提取花生粕中黃曲霉毒素B1。
表1 酶聯(lián)免疫法檢測花生粕中黃曲霉毒素B1
花生粕經(jīng)50%乙醇-水、30%乙腈-水、80%乙腈-水不同提取溶劑提取后,使用商品化黃曲霉毒素B1熒光快速定量檢測試紙條檢測結(jié)果如表2 所示。實驗結(jié)果顯示,與定值結(jié)果相比,用50%乙醇-水溶劑提取的樣品檢測結(jié)果偏低,回收率在46.8%~73.7%;用80%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結(jié)果也偏低,回收率在59.0%~73.1%;而用30%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結(jié)果回收率在88.5%~99.9%。結(jié)果表明不同提取溶劑的提取效率有所差異,對于所使用的商品化熒光快速定量檢測試紙條來講,其更適合使用30%乙腈-水溶劑提取花生粕中黃曲霉毒素B1。
表2 熒光定量免疫層析法檢測花生粕中黃曲霉毒素B1
花 生 粕 經(jīng)50% 乙 醇- 水、30% 乙 腈- 水、80%乙腈-水不同提取溶劑提取后,使用商品化黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測試紙條檢測結(jié)果如表3 所示。結(jié)果顯示,與定值結(jié)果相比,用50%乙醇-水溶劑提取的樣品檢測結(jié)果偏低,回收率在56.2%~66.9%;用80%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結(jié)果也偏低,回收在67.2%~84.9%;而用30%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結(jié)果的回收在84.5%~103.3%。結(jié)果表明不同提取溶劑的提取效率有所差異,對于所使用的商品化膠體金快速定量檢測試紙條來講,其更適合使用30%乙腈-水溶液提取花生粕中黃曲霉毒素B1。
表3 膠體金定量免疫層析法檢測花生粕中黃曲霉毒素B1
本實驗結(jié)果顯示,商品化黃曲霉毒素B1快速檢測花生粕的結(jié)果因提取溶劑的不同,回收率不同,現(xiàn)有商品化快速檢測產(chǎn)品中提取溶劑不適用花生粕的檢測。經(jīng)對比,30%乙腈-水提取溶劑均適用于商品化黃曲霉毒素B1ELISA 檢測檢測試劑盒、黃曲霉毒素B1熒光快速定量檢測試紙條和黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測試紙條。食品加工企業(yè)、飼料加工企業(yè)以及花生粕原料貿(mào)易可使用此方法對花生粕中黃曲霉毒素B1進行快速檢測。
本實驗是基于現(xiàn)有商品化快速檢測產(chǎn)品進行開展,并未對市面上所有商品快速檢測產(chǎn)品進行研究,此提取溶劑不一定適用于其他商品化快速檢測產(chǎn)品。不同提取溶劑的選擇對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜法等儀器檢測方法是否也有同樣的影響還需進一步探討及研究。