馬澤萌，陳允梓

南京醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學系，江蘇 南京 211166

維生素D（vitamin D，VD）是一種脂溶性維生素［1］，不僅調(diào)節(jié)鈣磷代謝和骨健康，在免疫系統(tǒng)［2］、神經(jīng)系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，它通過與維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）結(jié)合而發(fā)揮作用［3-4］。VD 與VDR 的結(jié)合能激活VDR 發(fā)生核轉(zhuǎn)位，在細胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能，啟動下游基因的表達，從而參與細胞的生長分化與免疫應答的調(diào)控［5-7］。

核定位信號（nuclear localization sequence，NLS）是蛋白質(zhì)實現(xiàn)核轉(zhuǎn)位的重要結(jié)構(gòu)域，通常由4～8 個氨基酸組成的短序列，含有Pro、Lys和Arg。有研究表明，VD 在細胞內(nèi)主要通過激活VDR 發(fā)生核轉(zhuǎn)位發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能［8-9］，VDR核定位信號可能位于兩個鋅指結(jié)構(gòu)之間，其氨基酸序列與核定位相關(guān)［10-11］，但缺乏精確定位和實驗鑒定。研究表明，VDR在胞質(zhì)中也發(fā)揮功能，它能與IKKβ相互作用并抑制NF?κB的激活［12］。因此，VDR的生物學功能與其細胞定位密切相關(guān)，確定VDR 的NLS 對深入了解VDR 信號具有重要意義。本研究采用軟件分析預測NLS并進行點突變驗證，確定了VDR的NLS序列及其對VDR 活性的影響，為VD 及VDR 的入核信號通路的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

VD 由美國芝加哥大學Yanchun Li 教授贈送。胰酶、胎牛血清（Gibco 公司，美國），PVDF 膜（Bio?Rad公司，美國），Triton X?100、Tris、NP40、甘油和吐溫20（合肥Biosharp公司），NaCl、KCl、EDTA（上海凌峰化學試劑有限公司），膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（上海Omega Bio?tek公司），HA抗體（Abmart公司，美國），Tublin 抗體、VDR 抗體（Santa Cruz 公司，美國），HRP 標記抗兔IgG 抗體、HRP 標記抗鼠IgG抗體（Jackson Immune Research 公司，美國），LaminB抗體、Tris?HCl pH 8.8、Tris?HCl pH 6.8、抗熒光猝滅劑、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（上海碧云天技術(shù)有限公司），組織固定液（武漢賽維爾生物科技有限公司），Poly?JET（濟南Signa?Gen），GAPDH抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），所有引物由南京金斯瑞公司合成。SYBR Green QPCR 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、點突變試劑盒（Mut Express ⅡFast Mutagenesis Kit V2）（南京諾唯贊生物科技有限公司）。

pCMV?HA?VDR 質(zhì)粒由本實驗室提供［6］，HEK293T和HeLa細胞來自美國ATCC。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計

對質(zhì)粒引入單堿基或多堿基的定點突變，引物設(shè)計如表1，采用點突變試劑盒在質(zhì)粒pCMV?HA?VDR 上構(gòu)建了突變體HA?VDR（R49W/R50G）、HA?VDR（K53Q/R54G/K55EP）、HA?VDR（R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E）。

表1 VDR基因點突變引物Table 1 VDR gene point mutation primers

1.2.2 實時熒光定量PCR分析

在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及VD 刺激后，收集HeLa 細胞，采用TRIzol 試劑提取總RNA，并根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用SYBR Green QPCR 試劑盒，在StepOnePlus（Applied Biosystems）上分析cDNA，進行靶基因的擴增（表2）。

表2 實時熒光定量PCR引物Table 2 Real?time fluorescent quantitative PCR primers

1.2.3 VDR的亞細胞定位分析

HEK293T 細胞進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，經(jīng)VD 處理后收集細胞。采用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒分別獲得胞質(zhì)和胞核組分，點樣10%聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）進行電泳分離，再經(jīng)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，進行5%BSA室溫封閉1 h。一 抗分別采用VDR、Tubulin和Lamin B 抗體，4 ℃孵育過夜，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗免多聚抗體，室溫孵育1 h。最后采用ECL 化學發(fā)光法檢測，在蛋白分析儀拍攝下進行結(jié)果分析。

1.2.4 免疫熒光分析

細胞樣品采用4%多聚甲醛固定，室溫15 min，PBS清洗2遍，再用0.02%NP?40處理15 min。然后用QuickBlockTM免疫染色封閉液封閉15 min，進行一抗HA 抗體孵育，4 ℃過夜。次日，PBS（含0.5%Tri?tion X?100）清洗后，加入熒光標記的二抗室溫孵育1 h。最后復染DAPI，細胞樣品進行熒光顯微鏡的圖像采集并分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x ± s）表示，多組定量資料比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA）檢驗，多組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用LSD 法。兩組定量數(shù)據(jù)比較用t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VDR核定位信號的預測

為了初步確定VDR的核定位信號位置，借助在線預測網(wǎng)站對VDR 氨基酸全序列進行了分析（http：//nls ? mapper.iab.keio.ac.jp/cgi ? bin/NLS_Map?per_form.cgi），預測結(jié)果顯示核定位信號序列為49RRSMKRKALFLT61（圖1A）。對不同物種來源的VDR進行序列比對，發(fā)現(xiàn)預測的核定位信號序列具有很好的保守性（圖1B）。

圖1 預測VDR核定位信號Figure 1 Predicting the nuclear localization signal of VDR

2.2 VDR突變體的構(gòu)建

根據(jù)預測的結(jié)果和文獻報道［10］，針對VDR核定位序列中的保守氨基酸精氨酸（R）和賴氨酸（K）進行點突變設(shè)計，采用點突變試劑盒（Mut Express ⅡFast Mutagenesis Kit V2）以質(zhì)粒pCMV?HA?VDR 為模板，構(gòu)建了一系列突變體（R49W/R50G、K53Q/R54G/K55E 和R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E），通過Vector NTI 軟件對測序結(jié)果進行分析，結(jié)果顯示VDR突變體成功引入突變點（圖2）。

圖2 構(gòu)建VDR點突變Figure 2 Constructing VDR point mutations

2.3 VDR點突變抑制其入核能力

為了驗證點突變是否對VDR核定位產(chǎn)生影響，將VDR 突變體（HA?VDR、HA?VDR?R49W/R50G、HA?VDR?K53Q/R54G/K55E、HA?VDR?R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E）轉(zhuǎn)染HEK 293T 細胞進行表達。在VD 100 nmol/L處理前后，分別獲取細胞樣品進行核質(zhì)分離，并采用Western blot 分析，其中Tubulin為胞質(zhì)內(nèi)參，Lamin B為胞核內(nèi)參。結(jié)果表明，VD處理能誘導野生型VDR 轉(zhuǎn)位細胞核內(nèi)（圖3A），而VDR突變體VDR（R49W/R50G），VDR（K53Q/R54G/K55E）和VDR（R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E）的表達主要停留在胞質(zhì)中，不能被VD 誘導轉(zhuǎn)位入細胞核（圖3B～D）。由此可見，在預測的NLS里這些保守位點的突變抑制了VDR進入細胞核，初步確定它們是VDR入核的關(guān)鍵位點。

圖3 VDR的點突變抑制其核定位Figure 3 VDR point mutations inhibit the transfer of VDR to the nucleus

接著，采用免疫熒光法直接觀察VDR點突變對其空間分布的影響。在HeLa細胞中轉(zhuǎn)染VDR及其突變體載體，觀察這些蛋白的表達在VD 刺激前后在細胞空間上的分布差異，以DAPI 標記細胞核，紅色熒光標記HA?tag 指示VDR 及變體的所在位置。如圖4 結(jié)果所示，在VD 刺激下，野生型HA?VDR 發(fā)生明顯轉(zhuǎn)位進入細胞核，而VDR 突變體在VD 刺激前后，細胞內(nèi)的空間分布并未發(fā)生明顯變化，與上述Western blot 結(jié)果一致，表明這些點突變位點是VDR核定位的關(guān)鍵位點。

圖4 VDR點突變影響VDR在細胞內(nèi)的分布Figure 4 VDR point mutations affect the spatial distribution of VDR in cells

2.4 VDR點突變減弱了對下游基因表達的調(diào)控

VD 的生物學功能主要由VDR 下游基因?qū)崿F(xiàn)。Cyp24a1、Atp2b1 是VDR 調(diào)控的下游基因［13-14］，而Cyp27A 不受VDR 調(diào)控作為陰性對照。在HEK 293T 細胞里瞬時表達HA?VDR 及點突變體，采用100 nmol/L VD 處理，收集細胞樣品進行qPCR 檢測。如圖5所示，在VDR 表達的細胞里，VD 可以有效誘導Cyp24a1 mRNA、Atp2b1 mRNA 水平上調(diào)；而在VDR 點突變表達的細胞中，VD 誘導Cyp24a1 mRNA、Atp2b1 mRNA 表達的能力顯著降低，說明VDR 的點突變能削弱了VD 的生物學功能，不能有效響應VD信號啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。

圖5 VDR的點突變影響了VDR對下游基因的轉(zhuǎn)錄Figure 5 VDR point mutations affect the transcription of downstream genes by VDR

3 討論

VDR的活性受VD調(diào)控，在一些疾病如癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫性疾病的研究中已成為預防、診斷和治療的重要靶點分子［15-19］。VD 與VDR 結(jié)合能激活VDR入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能，確定其NLS有助于進一步了解VDR在細胞核和細胞質(zhì)中的不同功能，為研究相關(guān)疾病提供參考依據(jù)。

根據(jù)在線網(wǎng)站預測分析VDR 的核定位信號位置，提示VDR的NLS為49RRSMKRKALFLT61，并且通過序列比對顯示在不同種屬VDR 序列里該NLS 具有很好的保守性。根據(jù)NLS保守性分析，針對49/50位、53/54/55位、49/50/53/54/55位的保守氨基酸進行突變，通過Western blot 和免疫熒光等方法進行檢測，結(jié)果顯示：當VD 刺激后，野生型VDR 能快速入核；而VDR 的NLS 突變都能有效抑制VDR 入核，證明了這些氨基酸位點參與調(diào)控VDR 的入核。據(jù)文獻報道，VD 與VDR 結(jié)合能啟動生物反應，啟動下游基因如CYP24A1、ATP2B1 等的轉(zhuǎn)錄。通過qPCR檢測這些下游基因，結(jié)果表明突變體VDR明顯抑制了CYP24A1、ATP2B1 的mRNA 表達，確定了這5 個位點是VDR 入核并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵位點?；谶@些VDR點突變體不能入核的性質(zhì)，提示這些點突變體可作為研究胞質(zhì)VDR功能的新工具，應用于VDR的相關(guān)研究［20］。

通常，精氨酸（R）可以被甲基化修飾，賴氨酸（K）可以被泛素化修飾，而這些蛋白質(zhì)的后加工修飾形式也可以調(diào)控蛋白質(zhì)的核定位行為，例如：Laims 蛋白能發(fā)生泛素化調(diào)節(jié)其核定位［21］，PRMT1甲基化酶能使p14ARF蛋白發(fā)生甲基化修飾調(diào)節(jié)該蛋白的核定位［22］。因此，對于VDR點突變體不能入核的現(xiàn)象，推測還存在另一個可能：當精氨酸和賴氨酸位點進行點突變后，可能抑制了VDR的泛素化或甲基化的后加工形式，從而影響VDR的入核行為。是否VDR的這些位點會發(fā)生后加工修飾參與VDR核定位的調(diào)節(jié)呢？這也是一個值得探究的問題。

總之，本研究通過預測分析，點突變體的構(gòu)建，結(jié)合亞細胞定位分析和qPCR 等方法，確定了VDR的核定位信號為49RRSMKRKALFLT61，并且證明了這5 個位點（49/50/53/54/55）的突變能夠影VD/VDR信號的生物學活性，這一發(fā)現(xiàn)為探索VDR 在細胞質(zhì)和細胞核中的作用提供研究平臺，為探討VD/VDR 相關(guān)疾病的預防、診斷和治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。