莊一波，楊 勇，寧晶晶

常州市第一人民醫(yī)院兒科，江蘇 常州 213004

糖尿病腎臟?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病的一種進行性微血管并發(fā)癥，由腎小球毛細血管損傷引起。其病理表現(xiàn)為持續(xù)性蛋白尿、腎小球濾過率降低、動脈血壓升高等［1］。迄今為止，DKD已成為糖尿病患者預期壽命縮短的主要原因。由于糖尿病發(fā)病率的增加，DKD的年發(fā)病率在過去10年中增加了1 倍以上。目前DKD 約占終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）病例的50%［2］。DKD的發(fā)病機制十分復雜，尚未明確。一般認為足細胞損傷、減少以及蛋白尿是DKD 的主要病理因素［3］。足細胞是腎小球的先天細胞之一，從根本上充當腎小球濾過膜的最后一道屏障。多種原因引起的足細胞損傷使腎小球濾過膜的通透性增加，導致蛋白尿，加速腎臟疾病的進展［4］。血小板反應蛋白（thrombospondins，TSP）是一組多域糖蛋白，存在于胚胎的細胞外基質(zhì)中。它們通過與受體分子結(jié)合而負責細胞?細胞相互作用和細胞?基質(zhì)相互作用［5］。TSP有5個家族成員，其中TSP?4是一種細胞外鈣結(jié)合蛋白，具有調(diào)節(jié)細胞遷移、增殖、黏附和組織重塑等多種功能［6］。TSP?4在保護心臟中發(fā)揮重要作用，包括心肌組織重塑和心肌肥大的預防。它也是一種與癌癥相關的調(diào)節(jié)劑。TSP?4可通過觸發(fā)血管生成，可作為治療癌癥的新靶點。此外，TSP?4還具有調(diào)節(jié)肌腱和骨骼肌的結(jié)構和功能的作用。文獻報道了TSP?4在加速瘢痕形成和介導局部炎癥反應中的作用［7-8］。目前TSP?4 在DKD 中的作用機制研究較少。本研究旨在探討TSP?4在高糖（high glucose，HG）誘導的足細胞損傷中的作用及其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠足細胞系（ATCC，美國），RPMI 1640 培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶（HyClone 公司，美國），胎牛血清（Gibco 公司，美國），TRIzol、Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司，美國）。鼠抗TSP?4 多克隆抗體（R&D 公司，美國），增強化學發(fā)光法（enhanced che?miluminescence，ECL）試劑盒、細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit?8，CCK?8）、5?乙炔基?2’脫氧尿嘧啶核苷（5?ethynyl?2’?deoxyuridine，EdU）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、Hoechst 33342試劑盒、RIPA裂解液、葡萄糖、兔抗信號轉(zhuǎn)導因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）多克隆抗體、兔抗p?STAT3 多克隆抗體和抗β?actin 單克隆抗體等（上海碧云天生物技術公司），STAT3 激動劑Colivelin（Selleck 公司，美國），實時熒光定量聚合酶鏈反應（real?time quantitative PCR，qRT?PCR）試劑盒（TaKaRa公司，日本），Annexin V?FITC（BD Biosciences 公司，美國），EdU溶液、酶標儀（Thermo Fisher Scientific 公司，美國），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）使用試劑盒（南京建成生物工程研究所），2’，7’?二氯熒光素二乙酸酯（2’，7’?dichloro?fluorescin diacetate，DCFH?DA）（Sigma 公司，美國），電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（北京六一公司），凝膠成像系統(tǒng)（Bio?Rad 公司，美國），雙熒光素酶報告系統(tǒng)（Pro?mega 公司，美國），高速低溫離心機器（Eppendrof 公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

小鼠足細胞系在RPMI164037℃培養(yǎng)，以30mmol/L葡萄糖刺激作為HG 組，5 mmol/L 葡萄糖誘導作為陰性對照組。使用Lipofectamine 2000 常規(guī)進行細胞轉(zhuǎn)染。接種在24 孔板中的細胞生長至30%～50%。6 h更換新鮮培養(yǎng)基。48 h后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應

使用TRIzol 收集總RNA。使用商業(yè)試劑盒從總RNA 的逆轉(zhuǎn)錄中獲得cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix將其用作qRT?PCR的模板。95 ℃預變性30 s，95 ℃10 s 變性，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s循環(huán)40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參，相對水平采用2-ΔΔCT法計算。GAPDH 的序列為5′?AGGTCGGTGT?GAACGGATTTG?3′（正向）和5′?GGGGTCGTTGATG?GCAACA?3′（反向），TSP?4的序列為5′?ACCGACAG?TAGAGATGGTCTTCC?3′（正向）和5′?CGTCACAT?CTGAAGCCAGGAGA?3′（反向）。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法

細胞裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，使用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度后，制備蛋白質(zhì)樣品用于SDS?PAGE（每泳道30 μg）并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。在特定條件下阻斷膜上的非特異性抗原后，用一抗［抗TSP?4（1∶2 000）、抗STAT3（1∶2 000）和抗p?STAT3（1∶2 000）］和二抗（1∶5 000）。使用ECL方法檢測蛋白質(zhì)信號。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme?linked immuno?sorbent assay，ELISA）

收集細胞上清液，5 000 r/min、4 ℃離心10 min。按照推薦使用ELISA 試劑盒檢測促炎因子的相對水平。

1.2.5 流式細胞術

PBS洗滌后，離心細胞并重懸。在黑暗中用10 μL Annexin V?FITC 誘導細胞，然后1 000 r/min 離心5 min。重懸的沉淀劑在4 ℃避光下用5 μL PI 進一步誘導。使用流式細胞術在30 min 內(nèi)檢查凋亡細胞。通過PI染色類似地檢查細胞周期分布。

1.2.6 CCK?8檢測

細胞接種于96孔板中，接種量為3×103個/孔?？瞻捉M只填充培養(yǎng)基。在指定時間點，每孔加入10 μL CCK?8溶液，培養(yǎng)4 h。通過酶標儀測量450 nm處的光密度值。

1.2.7 EdU檢測

將細胞以1×106個/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)過夜。使用EdU溶液染色，Hoechst 33342用于在黑暗中染色細胞核。捕獲了EdU 染色的細胞（紅色）、Hoechst 33342 染色的細胞核（藍色）以及合在一起的細胞圖像。

在妊娠前半期，支持胎兒腦神經(jīng)發(fā)育的甲狀腺激素主要來自母體。妊娠期患有甲狀腺疾病的患者也要攝取足夠的碘，食用加碘食鹽是最好的方法?；加凶陨砻庖呒谞钕傺缀图谞钕俟δ軠p退的妊娠婦女，還要定期監(jiān)測甲狀腺功能。

1.2.8 MDA、SOD和CAT的測量

MDA、SOD和CAT的相對水平使用試劑盒按照建議進行檢測。

1.2.9 活性氧（reactive oxygen species，ROS）的測量

DCFH?DA 方法測量細胞內(nèi)ROS 水平。分別測量了485 nm 發(fā)射波長和530 nm 發(fā)射波長下的光密度。

1.2.10 染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipi?tation，ChIP）

2×107個細胞用1%甲醇裂解，超聲處理制備200～1 000 bp 的DNA 片段。細胞裂解物與1 μg 抗IgG 或抗STAT3 一起孵育。然后在4 ℃下在20 μL蛋白A/G 免疫沉淀磁珠中誘導染色質(zhì)上清液過夜。第2 天，蛋白質(zhì)?DNA 復合物被洗脫和純化，獲得的DNA樣品進行qRT?PCR。

1.2.11 雙熒光素酶報告基因檢測

將接種在96 孔板中的細胞與含有野生型或突變型TSP?4啟動子和STAT3的小干擾RNA（small in?terfering?STAT3，si?STAT3）/陰性siRNA 序列（si?neg?ative control，si?NC）的pGL3熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染。雙熒光素酶報告系統(tǒng)用于測量相對熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學方法

Western blot 圖像的數(shù)據(jù)提取使用Image Lab 軟件。使用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析。兩組間的對比在正態(tài)性檢驗之后用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。所有實驗重復3次。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HG誘導的足細胞中TSP?4的上調(diào)

檢測HG 誘導0、24、48、72 h 的足細胞中TSP?4的表達水平。結(jié)果表明，TSP?4的核酸（圖1A）和蛋白質(zhì)水平（圖1B、C）均呈時間依賴性上調(diào)，在72 h達到峰值。

圖1 HG呈時間依賴性誘導足細胞中TSP?4的表達Figure 1 Upregulation of TSP?4 in HG?induced podocytes

2.2 干擾TSP?4抑制HG誘導的足細胞凋亡

足細胞凋亡是DKD 發(fā)展過程中的一個重要事件。我們發(fā)現(xiàn)在足細胞中，HG 降低了細胞活力和EdU 陽性細胞比例（圖2A～C）。有趣的是，我們應用siRNA 干擾了TSP?4 后，細胞活力和EdU 陽性細胞顯著高于對照組，表明干擾TSP?4 后促進了足細胞的增殖。流式細胞術結(jié)果表明HG刺激增加了G1期的細胞凋亡率和細胞比例，但是應用si?TSP 后會抑制這種情況（圖2D、E）。因此，抑制TSP?4的表達可以阻斷HG誘導的足細胞損傷。

圖2 干擾TSP?4抑制HG誘導的足細胞凋亡Figure 2 Knockdown of TSP?4 inhibits HG?induced apoptosis in podocytes

2.3 干擾TSP?4可減輕HG誘導的足細胞氧化應激

氧化應激有助于DKD的惡化。為了確定TSP?4對HG 誘導的足細胞氧化應激的影響，我們使用DCF?DA 方法檢測了細胞內(nèi)ROS 水平。結(jié)果表明HG 誘導ROS 的表達，可被si?TSP?4 逆轉(zhuǎn)（圖3A）。此外，還檢測了MDA、SOD 和CAT 的相對表達水平。HG 誘導的足細胞中MDA 表達升高，SOD 和CAT活性降低，與HG誘導ROS的表達變化一致，從而進一步證明HG誘導了氧化應激。但它們的水平均可通過si?TSP?4來逆轉(zhuǎn)（圖3B～D）。

圖3 干擾TSP?4減輕HG誘導的足細胞氧化應激Figure 3 Knockdown of TSP?4 alleviates oxidative stress in HG?induced podocytes

2.4 干擾TSP?4抑制HG誘導的足細胞炎癥反應

我們通過檢測促炎因子的相對表達水平，進一步檢查了TSP?4 在HG 誘導的足細胞炎癥反應中的潛在作用。HG 上調(diào)足細胞中IL?1β、TNF?α和IL?6的表達水平，并且應用si?TSP?4 后它們的表達水平降低（圖4）。因此，干擾TSP?4可有效抑制HG誘導的炎癥反應。

2.5 STAT3激活TSP?4的轉(zhuǎn)錄

使用JASPAR 預測TSP?4 啟動子區(qū)域中的潛在結(jié)合位點與STAT3結(jié)合（數(shù)據(jù)未顯示）。STAT3是一種經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子，它通過靶向基因表達來介導基因表達。發(fā)現(xiàn)p?STAT3 在HG 誘導的足細胞中呈時間依賴性上調(diào)（圖5A、B）。加入STAT3 激動劑Colivelin 后，TSP?4 的表達水平明顯上調(diào)，抑制STAT3 的表達可顯著下調(diào)TSP?4（圖5C、D），表明STAT3可能介導TSP?4的轉(zhuǎn)錄。推測STAT3通過直接結(jié)合其啟動子來激活TSP?4 的表達水平。通過ChIP 檢測分析，證實STAT3 蛋白能夠與TSP?4 的啟動子結(jié)合（圖5E）。此外，雙熒光素酶報告基因檢測闡明STAT3 激活了野生型TSP?4 的啟動子，而不是突變型1（圖5F、G）。故足細胞中的TSP?4 可以被STAT3激活。

圖5 STAT3激活TSP?4的轉(zhuǎn)錄Figure 5 STAT3 activates the transcription of TSP?4

3 討論

DKD的全球死亡率相對較高。更重要的是，隨著發(fā)病率的逐年增加，醫(yī)療費用增多。DKD的發(fā)病機制非常復雜且不確定，涉及多種類型細胞和各種因素［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，TSP?4 在HG 誘導的足細胞中顯著上調(diào)，從而加劇了足細胞的凋亡和炎癥反應。文獻報道HG刺激導致細胞中大量產(chǎn)生晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE），并不斷積累［11］。同時，在AGE的產(chǎn)生過程中，線粒體會釋放大量的ROS。過量的ROS 最終會導致氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導致細胞受損。氧化應激可直接導致足細胞凋亡，或通過肌動蛋白重排、內(nèi)皮素?1合成增加或微血管通透性改變等間接引起足細胞凋亡［12］。本研究結(jié)果表明，HG誘導的足細胞中ROS水平顯著增加，可通過抑制TSP?4 的表達而降低。這表明抑制TSP?4 的表達發(fā)揮了抗氧化作用。

氧化應激與炎癥反應密切相關，它們的協(xié)同作用引發(fā)了DKD 的惡化。全身和局部炎癥反應都參與了DKD的發(fā)展。以往研究表明，DKD患者腎臟中過量的ROS會誘導炎癥細胞的浸潤和募集，從而進一步加速IL?1β、IL?6、TNF?α和NF?κB等促炎因子的產(chǎn)生，并啟動DKD的發(fā)作［13］。血漿IL?6和TNF?α也有助于DKD 的進展。它們能夠提高系膜細胞的增殖率，擴大細胞外基質(zhì)，重要的是通過在正反饋回路中產(chǎn)生ROS來增加內(nèi)皮細胞通透性［14］。NF?κB是啟動糖尿病炎癥反應的主要轉(zhuǎn)錄因子。它在DKD患者的腎臟中上調(diào)，可以調(diào)節(jié)黏附分子和促炎因子如MCP?1、TNF?α和IL?6 的表達水平［15］。文獻報道［16］ESRD 患者粒細胞和單核細胞中Mac?1（CD11b/CD18）上調(diào)與血漿MDA 含量增加以及超氧化物和過氧化氫的產(chǎn)生有關，表明氧化應激和炎癥反應之間存在相互作用。本研究發(fā)現(xiàn)干擾TSP?4的表達可抑制HG誘導的足細胞中炎癥因子水平的增加。然而，TSP?4的相關炎癥機制尚不清楚。

STAT3位于人染色體17q21.2，通過作用于細胞表面的多肽受體發(fā)揮生物學效應［17］。它是一種參與DKD 發(fā)病機制的功能性轉(zhuǎn)錄因子。抑制STAT3活性可以減輕大鼠DKD 的發(fā)展［18］。本研究中，HG誘導的足細胞中STAT3的磷酸化水平顯著升高，通過誘導TSP?4轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)了TSP?4的表達水平。

本研究存在一些局限性。應用HG刺激足細胞形成體外DKD模型，在未來的研究中需要一個體內(nèi)DKD模型來驗證發(fā)現(xiàn)。此外，雖然發(fā)現(xiàn)STAT3調(diào)節(jié)TSP?4 的表達，但TSP?4 是否負責STAT3 的功能還需要進一步驗證。綜上所述，在HG 誘導的足細胞中TSP?4 上調(diào)，這可能是由STAT3 磷酸化水平增加引起的。抑制TSP?4的表達對減輕HG誘導的足細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應具有保護作用。結(jié)合本研究，認為TSP?4是DKD的一個重要的新治療靶點，為DKD的治療帶來了新的啟發(fā)和實驗依據(jù)。