童英，段小花，楊麗萍，陳普

(云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500)

腦梗死又稱缺血性腦卒中，指各種原因引起的血管受損、閉塞導(dǎo)致的大腦血氧供應(yīng)受損甚至中斷，局部缺血區(qū)域及鄰近受累的腦組織出現(xiàn)缺血缺氧性壞死，患者出現(xiàn)癱瘓、失語(yǔ)等相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損癥狀的一種急性腦血管疾病，約占急性腦血管疾病的75%，病死率居我國(guó)三大高死亡率疾病的首位[1]。腦梗死具有并發(fā)癥多、病情重、治療費(fèi)用高昂、治療周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，已成為嚴(yán)重的全球性疾病。近年來(lái)，疏通阻塞血管或恢復(fù)患病部位血液供應(yīng)一直是腦梗死的有效治療方法，但若血流恢復(fù)時(shí)間超過(guò)了再灌注時(shí)間窗，反而會(huì)加劇腦組織損傷，即發(fā)生腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)。再灌注可激活神經(jīng)元凋亡并導(dǎo)致海馬和皮質(zhì)損傷，進(jìn)一步惡化病情，引發(fā)腦水腫、腦出血等，使致殘率和致死率進(jìn)一步升高，嚴(yán)重威脅腦梗死患者的生存和預(yù)后，給社會(huì)與家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[2]。

腦是一個(gè)高能量需求器官，只能通過(guò)葡萄糖氧化供能，線粒體既是其產(chǎn)能的重要場(chǎng)所，又是腦組織中最豐富的細(xì)胞器，因此線粒體是腦組織能量需求的唯一來(lái)源，能量的充足對(duì)維持腦功能有重要影響，如釋放神經(jīng)遞質(zhì)[3]。研究證明，線粒體異常會(huì)加速CIRI，維持線粒體完整性可以保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，減少CIRI的病理進(jìn)展[4]。目前，以線粒體為靶點(diǎn)進(jìn)行腦保護(hù)已成為研究的熱點(diǎn)，如通過(guò)抑制促分裂原活化的蛋白激酶/線粒體凋亡途徑，從而在氧糖剝奪/恢復(fù)損傷期間促進(jìn)海馬神經(jīng)元活力[5]?，F(xiàn)就CIRI與線粒體凋亡的關(guān)系及其靶向研究進(jìn)行綜述，以期為腦梗死的治療提供新思路。

1 CIRI的病理、生理變化

溶栓治療并非使所有腦梗死患者獲益，部分患者經(jīng)溶栓治療后病情反而加重，出現(xiàn)CIRI，影響治療效果，因此，了解CIRI在腦梗死治療中至關(guān)重要。在腦缺血期間，動(dòng)脈血流量降低，腦組織缺血、缺氧，腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)合成效率降低，細(xì)胞內(nèi)酸性代謝產(chǎn)物增加，大量活性氧產(chǎn)生，且細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高。再灌注期間，血液和氧氣供應(yīng)恢復(fù)后，腦損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，包括線粒體功能障礙及細(xì)胞凋亡/壞死、能量障礙、自由基損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、Ca2+超載、血腦屏障的破壞、炎癥反應(yīng)、一氧化氮毒性、興奮性氨基酸的毒性作用、基因表達(dá)異常等[6-7]，不僅無(wú)法恢復(fù)已經(jīng)壞死細(xì)胞的功能，還可使受損傷并不嚴(yán)重的組織出現(xiàn)不可逆性壞死。其中，線粒體功能障礙是CIRI的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]，凋亡/壞死是細(xì)胞死亡的主要方式[9]，越來(lái)越多的科學(xué)研究和臨床證據(jù)分析顯示，再灌注后神經(jīng)元細(xì)胞的死亡與線粒體功能障礙引起的凋亡相關(guān)[10-13]。

2 再灌注后所致線粒體凋亡

再灌注后機(jī)體會(huì)啟動(dòng)各種與細(xì)胞死亡相關(guān)的程序，如壞死、凋亡或自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡[14-16]。其中，線粒體凋亡途徑被認(rèn)為是腦缺血后腦損傷的關(guān)鍵事件[14]，其具體路徑為再灌注期間線粒體受損，線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，Δψm)下降，大量活性氧堆積，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族促凋亡因子激活，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、Bak的高表達(dá)使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開(kāi)放，將細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中，在脫氧ATP和ATP共同存在的條件下與凋亡蛋白酶活化因子1相互作用，聚合形成凋亡小體，通過(guò)胱天蛋白酶(caspase)募集結(jié)構(gòu)域募集到caspase-9前體，從而促進(jìn)其裂解成活性形式，隨后通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活caspase-3、caspase-6、caspase-7等下游因子，使線粒體不可避免地發(fā)生凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]?？梢?jiàn)，內(nèi)在凋亡途徑起源于線粒體損傷，且線粒體在整個(gè)凋亡過(guò)程中發(fā)揮核心調(diào)節(jié)作用，即在某種意義上線粒體決定著神經(jīng)元細(xì)胞的存活和死亡[18]。再灌注后ATP衰竭、活性氧大量堆積、氧自由基損傷、Ca2+超載、mPTP異常開(kāi)放、Δψm異常、血腦屏障破壞、線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)受損、線粒體自噬等病理過(guò)程均可導(dǎo)致線粒體障礙，從而誘導(dǎo)線粒體凋亡通路，導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷甚至死亡。

3 引起線粒體凋亡的因素

3.1ATP衰竭 能量代謝障礙被認(rèn)為是CIRI發(fā)生的始發(fā)環(huán)節(jié)。腦缺血后，腦內(nèi)氧分壓持續(xù)下降，大部分有氧氧化途徑轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧糖酵解途徑，ATP合成減少，Na+,K+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性降低，大量乳酸在腦中蓄積，細(xì)胞內(nèi)H+濃度升高，受損組織發(fā)生代謝性酸中毒[19]。而過(guò)多H+又促使大量自由基產(chǎn)生[20]、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高[21]等，進(jìn)一步造成組織損傷。

再灌注過(guò)程中，腦組織血氧供應(yīng)恢復(fù)，同時(shí)大量線粒體損傷，線粒體呼吸鏈破壞，但此時(shí)線粒體有氧再灌注的恢復(fù)仍不能使腦組織進(jìn)行有效的有氧氧化產(chǎn)能，導(dǎo)致在再灌注恢復(fù)后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，糖酵解仍是腦組織的主要產(chǎn)能途徑[22]，該階段酸中毒進(jìn)一步加重，儲(chǔ)存的能量迅速被消耗，細(xì)胞和線粒體進(jìn)一步損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3.3Ca2+超載 在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度約為細(xì)胞外Ca2+濃度的10 000倍，在體內(nèi)神經(jīng)調(diào)節(jié)及傳遞中起重要作用。再灌注期間，各種不利因素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。而Ca2+的超負(fù)荷可通過(guò)以下多種途徑加劇線粒體損傷，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。①Ca2+超載誘導(dǎo)多種線粒體蛋白的去磷酸化，抑制ATP合成，并加速能量耗竭；②超量的Ca2+也會(huì)導(dǎo)致膜電位下降，并使mPTP開(kāi)放的閾值下降，決定了mPTP的開(kāi)放程度[28]；③Ca2+超載會(huì)釋放大量非酯化脂肪酸，如花生四烯酸，導(dǎo)致線粒體膜的流動(dòng)性減慢及通透性升高，使線粒體腫脹[29]，腦水腫加重。

3.4mPTP異常開(kāi)放 mPTP是位于線粒體內(nèi)、外膜之間的非特異性高導(dǎo)電性通道，主要由線粒體內(nèi)膜上的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶、線粒體外膜上的電壓依賴性陰離子通道、基質(zhì)上的親環(huán)蛋白D及其他蛋白組成的多蛋白復(fù)合物[30-32]，其受到基質(zhì)中Bcl-2蛋白家族中的20多種蛋白、磷酸鹽載體、己糖激酶、肌酸激酶、外周苯并二嗪受體等的調(diào)節(jié)，維持膜內(nèi)外離子的相對(duì)平衡，控制線粒體膜的通透性，參與保持穩(wěn)定的電勢(shì)差和膜電位的過(guò)程。生理情況下，mPTP處于關(guān)閉狀態(tài)，通過(guò)控制線粒體氧化磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)能量代謝。

再灌注期間，pH值增加，Ca2+、活性氧濃度逐漸持續(xù)升高，導(dǎo)致mPTP持續(xù)開(kāi)放，分子量低于1 500的分子非選擇性進(jìn)入線粒體內(nèi)膜[28]，從而破壞了Δψm，與氧化磷酸化解偶聯(lián)并導(dǎo)致ATP缺乏和細(xì)胞死亡。再灌注也增強(qiáng)了Bcl-2家族相關(guān)凋亡因子的激活，通過(guò)與電壓依賴性陰離子通道及其他促凋亡蛋白相互作用，形成蛋白滲透性孔，誘導(dǎo)mPTP開(kāi)放，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白釋放。mPTP的另一個(gè)重要作用是使線粒體膜通透性增加，線粒體腫脹而使線粒體受損[22,33]。有研究表明，阻斷再灌注后mPTP病理性開(kāi)放是減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、減輕CIRI的靶點(diǎn)之一[34]。

3.5Δψm異常 由三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的還原當(dāng)量還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和還原型黃素腺嘌呤二核苷酸分別將電子提供給復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅱ，這些電子通過(guò)呼吸鏈及復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)跨過(guò)內(nèi)膜泵入膜間隙所形成的電位差，即為Δψm。Δψm通過(guò)復(fù)合物Ⅴ提供質(zhì)子流入的驅(qū)動(dòng)力，將腺苷二磷酸和無(wú)機(jī)磷酸鹽濃縮生成ATP[35]。Δψm既是氧化磷酸化過(guò)程中能量?jī)?chǔ)存的中間形式，為ATP合成提供驅(qū)動(dòng)力，也是決定線粒體活性的一個(gè)因素，反映線粒體功能的完整性[36]。

研究發(fā)現(xiàn)，在缺血環(huán)境應(yīng)激下，線粒體Ca2+聚積，導(dǎo)致細(xì)胞色素C和其他線粒體呼吸鏈蛋白的去磷酸化[37]。再灌注過(guò)程中，線粒體呼吸鏈過(guò)度激活，出現(xiàn)病理性高Δψm，活性氧呈指數(shù)級(jí)增加，反過(guò)來(lái)誘導(dǎo)Δψm快速去極化，進(jìn)一步加重呼吸鏈損傷，最終導(dǎo)致ATP產(chǎn)能障礙，觸發(fā)細(xì)胞凋亡。目前，應(yīng)用“溫和解偶聯(lián)劑”改善氧化應(yīng)激水平，維持Δψm的最佳值，糾正線粒體損傷，可能成為腦組織保護(hù)的新方向。

3.6血腦屏障破壞 血腦屏障主要由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足、基底膜及周細(xì)胞組成，是控制血液和腦組織間物質(zhì)交換的復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)[38]。正常生理狀態(tài)下，絕大多數(shù)化合物無(wú)法通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，僅有一些脂溶性小分子和氣體分子可以進(jìn)入，可有效防止有害物質(zhì)侵入腦組織[39]。血腦屏障的完整性可維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，防止神經(jīng)元損傷并改善神經(jīng)功能[40]。

再灌注時(shí)，大量自由基促使細(xì)胞膜和毛細(xì)血管脂質(zhì)過(guò)氧化，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜損傷，血腦屏障結(jié)構(gòu)異常、完整性遭到破壞時(shí)，血腦屏障通透性增加，大分子物質(zhì)進(jìn)入腦組織和血漿成分外滲，導(dǎo)致腦水腫，是導(dǎo)致腦梗死致殘性并發(fā)癥的重要原因，直接影響患者預(yù)后[41]。

3.7mtDNA受損 線粒體是真核生物細(xì)胞中僅16 kb的半自主性細(xì)胞器，mtDNA具有獨(dú)立于細(xì)胞核染色體外的遺傳體系，含37個(gè)基因，其出現(xiàn)任何缺失和(或)突變均有可能影響線粒體功能，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[42]。mtDNA與氧化磷酸化場(chǎng)所(即線粒體內(nèi)膜之間的空間)的距離較近，且mtDNA自身結(jié)構(gòu)沒(méi)有組蛋白保護(hù)、缺乏有效的DNA修復(fù)系統(tǒng)，故易受到線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的自由基攻擊，導(dǎo)致mtDNA突變[43]。

再灌注時(shí)，活性氧暴增，mtDNA與活性氧產(chǎn)生部位鄰近，且mtDNA本身缺乏對(duì)損傷的自我修復(fù)能力，不能通過(guò)對(duì)損傷DNA堿基的切除進(jìn)行修復(fù)，易受到活性氧攻擊導(dǎo)致mtDNA缺失和(或)突變，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)破壞和功能受損，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時(shí)，mtDNA數(shù)量減少、線粒體生成能力下降，可引起線粒體氧化磷酸化功能下降，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞因能量匱乏而死亡。

3.8線粒體自噬 線粒體自噬是一種選擇性自噬過(guò)程，受到各種因子的精密調(diào)節(jié)，可識(shí)別機(jī)體內(nèi)受損的線粒體并及時(shí)清除，是調(diào)整線粒體數(shù)量的一種重要機(jī)制，主要通過(guò)PTEN誘導(dǎo)假定激酶1/Parkin介導(dǎo)[44-45]。有研究表明，線粒體自噬對(duì)機(jī)體的作用是雙向的，在一定程度上，線粒體自噬呈良性表達(dá)，通過(guò)清除體內(nèi)異常線粒體，減輕CIRI；但自噬可隨著再灌注導(dǎo)致的病理變化而過(guò)度激活，從而加重CIRI[46]。再灌注后，線粒體外膜蛋白Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3表達(dá)增加，自噬過(guò)度激活，線粒體裂解加速，引發(fā)細(xì)胞凋亡，加重CIRI[47-48]。

4 治 療

4.1中醫(yī)治療 目前，有關(guān)腦缺血研究已取得較多進(jìn)展，中醫(yī)藥治療因具有副作用小、高效等優(yōu)點(diǎn)而受到研究者的關(guān)注。有研究證明，桑枝[49]、丹參[50]、燈盞花、細(xì)辛[51]、黃芪[52]、天麻等藥物可減輕氧化損傷，進(jìn)而減輕CIRI；三七總皂苷[53]能降低大鼠腦內(nèi)Ca2+濃度，并使線粒體跨膜電位升高，阻斷mPTP開(kāi)放，從而減輕CIRI；牛黃[54]可通過(guò)抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，降低大鼠大腦中Bax、caspase-9、caspase-3和細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)，對(duì)CIRI發(fā)揮保護(hù)作用。敗醬總黃酮[55]可以改善腦組織能量代謝，減輕自由基損傷，保護(hù)腦組織。除傳統(tǒng)中藥外，電針療法也被廣泛用于CIRI的治療。

電針在CIRI中的應(yīng)用主要包括電針預(yù)處理和電針治療兩方面，電針預(yù)處理可通過(guò)減輕興奮性氨基酸毒性、調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因等減輕CIRI；電針治療主要通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝、促進(jìn)血管生成等減輕CIRI[56]。有研究表明，電針預(yù)處理可提高Bcl-2表達(dá)、降低Bax和caspase-3的表達(dá)，使細(xì)胞凋亡水平下降，從而抑制大鼠腦組織細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用[57]。此外，電針可通過(guò)清除自由基、抑制大鼠腦內(nèi)的氧化應(yīng)激，減少過(guò)氧化物的產(chǎn)生，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[58]。研究表明，3 mA強(qiáng)度電針可通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠腦線粒體的能量代謝減輕大鼠CIRI[59]。電針“百會(huì)”“大椎”穴可維持再灌注后線粒體的穩(wěn)定性，減少凋亡的發(fā)生[60]。

4.2西醫(yī)治療 細(xì)胞、動(dòng)物和人體研究的新發(fā)現(xiàn)表明，胎盤來(lái)源的線粒體移植可以減少腦缺血再灌注后的梗死[61]。木犀草素可通過(guò)逆轉(zhuǎn)線粒體腫脹和線粒體跨膜電位增強(qiáng)抗氧化能力[4]。此外，木犀草素可通過(guò)激活沉默信息調(diào)節(jié)因子3/AMP活化蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白途徑增強(qiáng)線粒體功能，減緩CIRI的病理進(jìn)展。瑞舒伐他汀通過(guò)調(diào)控解偶聯(lián)蛋白2-沉默信息調(diào)節(jié)因子3通路減輕再灌注對(duì)神經(jīng)元線粒體的損傷，從而發(fā)揮保護(hù)作用[62]。馬賽替尼能下調(diào)大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Bax等凋亡蛋白的表達(dá)，上調(diào)p62的表達(dá)，通過(guò)抑制線粒體過(guò)度自噬減緩CIRI病理進(jìn)程[63]。

5 小 結(jié)

CIRI與線粒體功能障礙密不可分，恢復(fù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能有助于CIRI的預(yù)防和治療。天麻、丹參等中藥可作用于多靶點(diǎn)，減輕線粒體損傷，對(duì)CIRI有保護(hù)作用；此外，中醫(yī)電針、胎盤來(lái)源線粒體移植等技術(shù)也在CIRI中相繼應(yīng)用，且療效明顯?？梢?jiàn)，從線粒體入手治療對(duì)CIRI有重要意義，但目前大多限于基礎(chǔ)研究(細(xì)胞水平、動(dòng)物實(shí)驗(yàn))，臨床診斷治療應(yīng)用率低，且線粒體功能障礙涉及復(fù)雜的病理過(guò)程，諸多文獻(xiàn)僅為單一機(jī)制的研究，未來(lái)應(yīng)系統(tǒng)研究線粒體在腦缺血再灌注病理過(guò)程中的作用，從而為靶向治療腦梗死提供新思路。