齊永芳(河南開放大學(xué) 鄉(xiāng)村振興學(xué)院，河南 鄭州 450046)

0 引言

席夫堿(Schiff base)也被稱作席夫氏堿，它主要是指結(jié)構(gòu)中含有亞胺或者甲亞胺特性基團(tuán)(—RC=N—)的有機(jī)化合物，通常由胺類與活性羰基有效縮合形成[1]。丹皮酚屬于中藥藥材丹皮的主要成分，結(jié)合早期研究成果，得知丹皮酚能夠改善心血管疾病。不過，受到其容易代謝及揮發(fā)的影響，直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)通常難以辨明結(jié)果[2]。本研究正是在丹皮酚羥基進(jìn)行有效的修飾情況下，生成丹皮酚席夫堿配合物，然后判斷該配合物的抗血小板聚集活性。以丹皮酚為基物，促使酮羰基和氨基發(fā)生反應(yīng)，生成席夫堿結(jié)構(gòu)，然后再應(yīng)用羰基和有機(jī)硝酸酯類實(shí)施偶聯(lián)，形成特定配合體。丹皮酚也被稱作牡丹醇或者牡丹酚，作為中藥牡丹皮及徐長卿的有效成分，具備較好的抗腫瘤藥理活性。按照其化學(xué)組成結(jié)構(gòu)特征，主要含有1，2，3—三氮唑結(jié)構(gòu)化合物，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)研究

1.1 儀器和試劑選擇

儀器種類：顯微熔點(diǎn)儀(上海儀器制備公司)；核磁共振儀(德國布魯克公司)；紅外光譜儀(美國Thermo Electron公司)[3]；液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀；薄層硅膠板等。試劑種類：硝酸銀；丹皮酚；二溴烷烴；甘氨酸；甲酰胺等。

1.2 配合物的合成

首先，在堿性狀態(tài)下，丹皮酚和甘氨酸發(fā)生反應(yīng)，生成丹皮酚亞胺基乙酸。其次，丹皮酚亞胺基乙酸的羧基和二溴烷烴發(fā)生反應(yīng)，生成溴代烷基酯類衍生物。最后，將得到的產(chǎn)物與硝酸銀發(fā)生反應(yīng)，生成硝酸酯類衍生物。

1.2.1 生成丹皮酚亞胺基乙酸鉀的過程

把甘氨酸(0.90 g)、氫氧化鉀(0.67 g)、無水乙醇(100 mL)共同加入至圓底燒瓶，加熱30 min(溫度保持在50 ℃)，然后再向其中均勻滴加丹皮酚(2.00 g)。在完成上述反應(yīng)后，持續(xù)攪拌特定時(shí)間，正確使用薄層色素法確保反應(yīng)進(jìn)行完全[4]。再將其實(shí)施冷卻，等到達(dá)室溫條件時(shí)，進(jìn)行抽濾和干燥處理，最終獲得丹皮酚亞胺基乙酸鉀(淡黃色的固體化合物)。

1.2.2 生成丹皮酚亞胺基乙酸-2-溴-乙基酯衍生物的過程

將上述反應(yīng)獲得的丹皮酚亞胺基乙酸鉀(1.30 g)、1, 2-二溴乙烷(0.9 mL)、甲酰胺(10 mL)加入至圓底燒瓶，對其實(shí)施攪拌(溫度控制在40 ℃)，借助薄層色素法觀察到反應(yīng)完全。將上述反應(yīng)液倒進(jìn)水中(100 mL)，利用二氯甲烷進(jìn)行萃取，針對獲得的有機(jī)相利用飽和氯化鈉進(jìn)行洗滌處理，再使用無水硫酸鈉對其進(jìn)行干燥和濃縮，最終利用乙酸乙酯石油醚的混合溶劑析出晶體，得到丹皮酚亞胺基乙酸-2-溴-乙基酯衍生物(淡黃色固體成分)。值得注意的是，在此階段，生成的丹皮酚亞胺基乙酸-2-溴-乙基酯衍生物包含五種類型，均呈現(xiàn)為淡黃色固體種類。

1.2.3 生成丹皮酚硝酸酯類衍生物的過程

取上步獲得的丹皮酚亞胺基乙酸-2-溴-乙基酯衍生物(500 mg)、硝酸銀(510 mg)，共同加入到50 mL的圓底燒瓶，再將乙腈(10 mL)添加其中，特定環(huán)境下予以攪拌(60 ℃)，利用薄層色譜法確定反應(yīng)完全。等滿足完全反應(yīng)后，將反應(yīng)液倒至水(100 mL)中，隨后利用二氯甲烷實(shí)施萃取，有機(jī)相采用飽和氯化鈉進(jìn)行洗滌，再借助無水硫酸鈉干燥處理，經(jīng)過濃縮后結(jié)晶，最終生成丹皮酚硝酸酯類衍生物(淡黃色固體)。

(1)針對丹皮酚亞胺基乙酸2-(硝氧基)乙基酯(4a)而言，表現(xiàn)特征：淡黃色固體，產(chǎn)率達(dá)到76.5%，m.p.82.2～82.9 ℃。核磁共振檢測期間：(1H:3.9 Hz)、(2H:(6.33～6.25 m))、(3H:(3.74～3.68 m))、(4H:(4.55～4.42 m))；IR(KBr)v:3 219，3 085，2 975，2 905，1 614，1 584，1 505 cm-1；ESI—MS m/z:336.012 8[M+Na]+。

(2)針對丹皮酚亞胺基乙酸3-(硝氧基)乙基酯(4b)而言，表現(xiàn)特征：淡黃色固體，產(chǎn)率達(dá)到76.3%，m.p.78.5～79.2 ℃。核磁共振檢測期間：(1H:8.0 Hz)、(2H:(6.31～6.02 m))、(3H:(3.72～3.51m))、(4H:(4.50～ 4.31m))；IR(KBr)v:3 312，2 980，1 652，1 592，1 425 cm-1；ESI—MS m/z:350.085 2[M+Na]+。

(3)針對丹皮酚亞胺基乙酸4-(硝氧基)乙基酯(4c)而言，表現(xiàn)特征：淡黃色固體，產(chǎn)率達(dá)到77.2%，m.p.71.3～71.5 ℃。核磁共振檢測期間：(1H:8.9 Hz)、(2H:(2.71～2.25 m))、(3H:(2.26～2.15 m))、(4H:(1.80～1.62 m))；IR(KBr)v:3 382，2 977，2 905，1 622，1 520，1 393 cm-1；ESI—MS m/z:362.102 0[M+Na]+。

(4)針對丹皮酚亞胺基乙酸5-(硝氧基)乙基酯(4d)而言，表現(xiàn)特征：淡黃色固體，產(chǎn)率達(dá)到74.1%，m.p.82.2～82.9 ℃。核磁共振檢測期間：(1H:8.8 Hz)、(2H:(6.26～6.29 m))、(3H:(1.69～1.83m))、(4H:(1.78～1.52 m))；IR(KBr)v:3 412，3 081，2 957，1 610，1 522，1 439 cm-1；ESI—MS m/z :392.132 6[M+Na]+。

(5)針對丹皮酚亞胺基乙酸4-(硝氧基)乙基酯(4e)而言，表現(xiàn)特征：淡黃色固體，產(chǎn)率達(dá)到79.2%，m.p.67.4～68.6℃。核磁共振檢測期間：(1H:8.9 Hz)、(2H:(1.46～1.35 m))、(3H:(2.29～3.70 m))、(4H:(1.72～ 1.59 m))；IR(KBr)v:3 413，2 950，1 621，1 105，1 447 cm-1；ESI—MS m/z :379.116 2[M+Na]+。

2 結(jié)果和討論

2.1 體外抗血小板聚集活性實(shí)驗(yàn)

研究對象為家兔(健康、雄性)，對家兔的耳緣靜脈予以注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，確保家兔處于麻醉狀態(tài)。滿足麻醉后，借助手術(shù)分離頸總動脈，抽取血液并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，然后利用枸櫞酸鈉溶液(3.2%)抗凝[5]。隨后在不同離心速率條件下進(jìn)行離心處理，分別獲得富血小板血漿(離心速度控制在800 r/min)和貧血小板血漿(離心速度控制在3 000 r/min)，采用比濁法實(shí)施血小板聚集實(shí)驗(yàn)[6]。

將獲得的樣品放置到二甲基亞砜進(jìn)行溶解，并對其實(shí)施稀釋處理(50 μmol/L)。在測試杯中加入受試樣品(10 μL)，預(yù)先加熱1 min(37 ℃)，然后再將其轉(zhuǎn)入到測試通道，添加誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(10 μL)，檢測在5 min時(shí)間內(nèi)的最大聚集值。同時(shí)，選擇二甲基亞砜(空白)、丹皮酚(陽性)、阿司匹林(陽性)作為對照，最終對比四組的血小板聚集抑制率。配合物對二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集活性影響，如表1所示。

表1 配合物對二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集活性影響

如表1所示，生成的堿生物功能配合物對血小板聚集能夠產(chǎn)生一定的抑制作用，其最終的抑制率在14.01%到22.03%之間，總體上活性小于丹皮酚(29.03%)與阿司匹林(33.12%)，上述結(jié)果反應(yīng)出堿化修飾后的配合物對提升抗血小板聚集活性的效果并不顯著。

2.2 體內(nèi)調(diào)血脂活性實(shí)驗(yàn)分析

在進(jìn)行體內(nèi)調(diào)血脂活性實(shí)驗(yàn)期間，采用的研究對象為小鼠(成年健康、雄性)，小鼠數(shù)量共96只，依次設(shè)置正常對照、模型對照[7]、丹皮酚給藥、配合物a給藥、配合物b給藥、配合物c給藥以及配合物d給藥、配合物e給藥這8個(gè)組別，每組實(shí)驗(yàn)小鼠為12只。在實(shí)驗(yàn)過程中，按照10 mg/kg的劑量進(jìn)行用藥，遵從1次/天的用藥頻率，對上述小鼠連續(xù)灌胃一周時(shí)間。最后一次給藥前的20個(gè)小時(shí)前(空白組除外)，對小鼠腹腔注射蛋黃乳液(體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%)，使其表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)性高血脂癥模型。最后給藥結(jié)束后的1個(gè)小時(shí)后，抽取小鼠血液，并分離出對應(yīng)的血清成分，應(yīng)用酶法測定出總膽固醇以及甘油三酯的濃度。配合物對高血脂癥小鼠總膽固醇及甘油三酯的影響如表2所示。

表2 配合物對高血脂癥小鼠總膽固醇及甘油三酯的影響

如表2所示，生成的配合物和模型組進(jìn)行對比時(shí)，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的調(diào)血脂功能?？傮w上，配合物降低甘油三酯的效果優(yōu)于丹皮酚組，并且活性也有優(yōu)于丹皮酚。上述結(jié)果表明，在以丹皮酚為基礎(chǔ)經(jīng)過系列反應(yīng)，最終生成的配合物能夠有效改善血脂偏高的功能。結(jié)合早期研究表明，發(fā)現(xiàn)丹皮酚具備舒張冠狀動脈的效果，可以有效保護(hù)缺血再灌注造成的損傷，還能夠展現(xiàn)出抗心律失常、抗血栓、抗腦出血以及降血壓的藥理作用。近些年來，隨著心血管疾病的發(fā)病率逐漸升高，最為常見的病癥屬于動脈粥樣硬化，按照該病癥產(chǎn)生的原因，發(fā)現(xiàn)其主要是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致一氧化氮的合成與釋放能力減弱，從而破壞掉內(nèi)皮細(xì)胞的合成、打破了血管活性物質(zhì)與細(xì)胞因子間的平衡關(guān)系。因?yàn)橐谎趸獙儆跈C(jī)體內(nèi)重要的信使物質(zhì)，會包含生理性、病理性過程，可以發(fā)揮出抗血栓、抗血細(xì)胞黏附、抗血栓等作用?；诖耍褂猛庠葱缘囊谎趸w藥物能夠顯著改善動脈粥樣硬化病變中的血管效應(yīng)，可以將一氧化氮供體與其他先導(dǎo)藥物進(jìn)行偶聯(lián)，從而獲得一氧化氮供體型的藥物。本研究通過以傳統(tǒng)中藥丹皮酚作為先導(dǎo)，可以在丹皮酚中合理引入一氧化氮釋放基團(tuán)，促使其和丹皮酚產(chǎn)生協(xié)同作用。

3 結(jié)語

本研究首先將丹皮酚視作先導(dǎo)化合物，利用酮羰基和甘氨酸進(jìn)行反應(yīng)，隨后生成含席夫堿結(jié)構(gòu)的中間體。再借助和硝酸酯類的偶聯(lián)，最終生成五種配合物。在對配合物活性展開研究時(shí)，從體外抗血小板凝聚和體內(nèi)調(diào)血脂活性兩個(gè)層面出發(fā)，最終發(fā)現(xiàn)該配合物能夠?qū)Χ姿嵯佘照T導(dǎo)的血小板聚集產(chǎn)生抑制作用，但總體效果有待提升。相對而言，這五種配合物具有顯著的調(diào)血脂能力，可以展現(xiàn)出降低總膽固醇的作用，活性優(yōu)于母藥丹皮酚，表明堿化生成的配合物能夠改善血脂狀況，活性較好。