張 柯，蔣春燕，吳少雄，楊臣菊，余正文

(貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

0 引言

紫雀花(Parochetuscommunis)又名金雀花、藍(lán)雀花、生血草、一顆血，為蝶形花科紫雀花屬草本植物[1]。生于2000 m左右海拔的山地和荒坡的陰涼、濕潤處。主要分布于貴州畢節(jié)、普安、興仁、遵義等地及四川、云南；印度、不丹、緬甸、斯里蘭卡和泰國等也有少量分布。紫雀花為貴州苗族同胞常用草藥，性味甘，微溫，有補腎壯陽之效，用于治療外感發(fā)熱、腎虛陽痿、水腫和瘰疬[2-3]。課題組前期對紫雀花藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初步研究[4]，從紫雀花中分離鑒定得到芒柄花素、芒柄花苷、美迪紫檀素、車軸草醇、3′, 6-二甲氧基-5′-羥基異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿佛洛莫生-7-O-β-D-葡萄糖苷、β-谷甾醇、1-三十烷醇、 鄰苯二酸二辛酯、鄰苯二酸二丁酯、新植二烯，其中芒柄花素、芒柄花苷和美迪紫檀素3個異黃酮含量較高[5-6]。進(jìn)一步對其不同部位進(jìn)行清除自由基活性研究，其乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有顯著的抗氧化活性，而芒柄花素和芒柄花苷并不是清除自由基的有效活性成分[7-8]。2020年Fumi Tatsuzawa從紫雀花中分離得到錦葵花素-3-O-鼠李糖苷、山奈酚3-O-(2-O-葡萄糖基-6-O-鼠李糖基)-葡萄糖苷和山奈酚3-O-(2，6-二-O-鼠李糖基)-葡萄糖苷[9]。芒柄花素和芒柄花苷是從黃芪、紅車軸草、甘草、葛根、雞血藤等中藥材中提取的異黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、舒張血管、調(diào)節(jié)血脂代謝、抗病毒等多種藥理活性[10-11]。美迪紫檀素具有抗菌、抗腫瘤活性[12-14]。藥用植物的藥效成分主要為次生代謝產(chǎn)物，其合成往往受到外因(環(huán)境因素)和內(nèi)因(遺傳因素)的共同影響。環(huán)境因素是影響藥用植物次生代謝產(chǎn)物合成與積累的首要因素，而環(huán)境因素為光照、水分、溫度、海拔等主要因素[15-16]。目前對于紫雀花的研究，主要集中在以芒柄花素為代表的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、化學(xué)成分研究，尚未將化合物含量進(jìn)行定量分析，且未將生態(tài)因子和化學(xué)成分相關(guān)聯(lián)，探討兩者之間的關(guān)系。

為此，本研究測定了貴州省不同產(chǎn)地紫雀花中芒柄花素、芒柄花苷、美迪紫檀素的化合物含量，并關(guān)聯(lián)海拔作相關(guān)性分析，闡明紫雀花3種藥效成分含量之間以及與海拔之間的關(guān)系，為指導(dǎo)黔產(chǎn)紫雀花的野生資源保護(hù)、人工引種地理區(qū)劃選擇以及全面質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜G1311A泵、G1315檢測器、Agilent色譜工作站均來自于Agilent；MS105DU電子天平(梅特勒-托利多集團(tuán))；DK-1500D數(shù)碼超聲波清洗機(jī)(得康洗凈電器有限公司)。

1.1.2 試劑

甲醇(德國默克 merck)；磷酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；芒柄花素(批號：111703-200602純度≥97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；芒柄花苷(自制，純度≥97%)；美迪紫檀素(自制，純度≥98%)；磷酸為分析純，水為超純水。

1.1.3 材料

樣品來源于貴州省黔西南州和畢節(jié)市，采集新鮮葉片，曬干，并記錄采集地海拔，見表1。經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為蝶形花科紫雀花屬植物紫雀花(Parochetuscommunis Buch.)，樣品保存于貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

表1 采樣點信息Tab.1 Information of sampling points

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

采用CAPCELL PAK C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL·min-1；波長：芒柄花苷和芒柄花素(254 nm)，美迪紫檀素(280 nm)。流動相：乙腈(A)-磷酸水溶液(0.1%)(B)；梯度洗脫：0～20 min，45% A；20～25 min，55% A。

1.2.2 供試品溶液

取不同產(chǎn)地樣品粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入10 mL甲醇，超聲提取30 min，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾。

1.2.3 對照品溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱取芒柄花苷0.46 mg、芒柄花素2.50 mg、美迪紫檀素2.75 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別依次取1 mL，2 mL，2 mL置于10 mL量瓶中，并用甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品儲備液。

1.2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密量取芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素混合儲備液0.5 mL，1 mL，2 mL，4 mL，6 mL，8 mL，10 mL，12 mL置于量瓶內(nèi)，加甲醇定容至刻度，搖勻。精密吸取各系列濃度的對照品溶液各20.0 μL，按照“1.2.1”項下色譜條件測定，以各對照品質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到芒柄花苷、芒柄花素及美迪紫檀素的回歸方程和線性范圍。

1.2.5 儀器精密度試驗

精密吸取紫雀花供試品溶液20.0 μL，按“1.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定芒柄花素、芒柄花苷、美迪紫檀素的峰面積，計算RSD值。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取紫雀花供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件測定0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h樣品中芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素含量，記錄色譜峰面積，計算機(jī)含量及其RSD。

1.2.7 重復(fù)性試驗

取6份紫雀花粉末，按“1.2.2”項下方法制備同一樣品6份，按“1.2.1”項色譜條件測定芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素，記錄色譜峰面積，計算含量及其RSD值。

1.2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的紫雀花粉末9份，每份約0.1 g，精密稱定，分別置具塞三角瓶中，按照樣品中含量的80%、100%、120%的加入“1.2.3”項下對照品溶液。按“1.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件測定，并記錄峰面積，計算加樣回收率。

1.2.9 樣品含量測定

分別取不同產(chǎn)地紫雀花樣品粉末3份，按“1.2.2”項下方法制備樣品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出不同產(chǎn)地紫雀花中芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍

芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍(見表2)，結(jié)果表明芒柄花素、芒柄花苷和美迪紫檀素在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，進(jìn)樣濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

表2 芒柄花素、芒柄花苷、美迪紫檀素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍Tab.2 Regression equation, correlation coefficients and linear ranges of the formononetin, ononin, medicarpin

2.2 精密度實驗結(jié)果

通過芒柄花素、芒柄花苷、美迪紫檀素的峰面積，計算RSD值分別為0.04，0.15，0.03，表明該方法下儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素在0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h內(nèi)RSD值分別為0.16，0.24，0.04；表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性試驗結(jié)果

通過6份紫雀花粉末含量測定計算的芒柄花苷、芒柄花素、和美迪紫檀素的RSD值分別為0.26，0.89，0.17；表明實驗重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗

所有樣品的加樣回收率均在90%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)誤差均小于5%(見表3)，表明本研究采用的樣品處理方法合符實驗要求。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.3 Results of the sample recovery test

2.6 樣品含量測定

不同產(chǎn)地紫雀花中芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素的含量。結(jié)果見圖1和表4。

表4 不同產(chǎn)地紫雀花中芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素含量

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

3 討論

3.1 不同產(chǎn)地紫雀花3種成分的比較

對貴州10個產(chǎn)地紫雀花中3種藥效成分進(jìn)行含量測定，結(jié)果如圖2所示，3種成分中美迪紫檀素含量最高，其次為芒柄花素、最低為芒柄花苷。此外，紫雀花3種藥效成分均在10個產(chǎn)地中檢出，且貴州省普安縣青山鎮(zhèn)海馬莊村的3種成分均較高。

圖2 不同產(chǎn)地紫雀花種3種化合物含量Fig.2 Contents of ononin, formononetin, medicarpin in Parochetus communis from different origin

3.2 紫雀花3種成分相關(guān)性分析

為了更好地研究紫雀花中3種藥效成分含量之間的關(guān)系及其與采樣地海拔之間的關(guān)系，對其進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果(如表5)表明，芒柄花素和芒柄花苷之間呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P<0.01)，與美迪紫檀素顯著相關(guān)(P<0.05)；芒柄花苷與美迪紫檀素顯著相關(guān)(P<0.05)。3種藥效成分均與紫雀花生長海拔呈負(fù)相關(guān)，表明高海拔不利于3種藥效成分的代謝積累，其中芒柄花苷受紫雀花生長海拔的影響較大。

表5 紫雀花3種成分相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis between three compounds of Parochetus communis

3.3 紫雀花中3種異黃酮化合物線性回歸預(yù)測模型

基于表4中3個藥效成分的含量結(jié)果，將芒柄花苷含量作為因變量，以上述相關(guān)性分析中顯著相關(guān)的成分芒柄花素和美迪紫檀素為自變量，應(yīng)用逐步回歸法建立預(yù)測模型。經(jīng)過逐步擬合，芒柄花素進(jìn)入回歸方程，形成最優(yōu)模型，模型的判定系數(shù)R2為0.708，估計值的標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.242，Durbin-Watson檢驗統(tǒng)計量為1.448，表明殘差獨立。逐步回歸擬合的線性方程結(jié)果表明芒柄花素對芒柄花苷的影響可達(dá)到67.2%。因此，基于芒柄花素含量(X)與芒柄花苷含量(Y)，構(gòu)建的線性回歸模型為Y=0.482X+0.002。參數(shù)經(jīng)t檢驗，其概率P值為0.002，具有顯著性。表明，芒柄花苷的含量會隨著芒柄花素含量的增加而增加。

3.4 聚類分析

對貴州10個不同產(chǎn)地的紫雀花3種藥效成分進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明10個產(chǎn)地樣品聚成兩類，其中DG、HZ、WT、HCZ、QXG為一類，LHJ、BP、DT、DST、HMZ為一類。

本研究通過對10個產(chǎn)地紫雀花的3種化合物成分進(jìn)行測定，并對其進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的芒柄花素和芒柄花苷之間差異顯著，且根據(jù)線性回歸預(yù)測模型預(yù)測其呈線性關(guān)系。聚類分析發(fā)現(xiàn)，貴州省興仁市新龍場鎮(zhèn)冬瓜村、貴州省赫章縣河鎮(zhèn)鄉(xiāng)恒底村、貴州省興義市萬屯鎮(zhèn)萬屯村、貴州省興義市烏沙鎮(zhèn)納姑村、貴州省畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)殷官屯村聚為一類；貴州省興仁市雨樟鎮(zhèn)龍頭箐村 、貴州省興仁市潘家莊鎮(zhèn)粑鋪村、貴州省興仁市新龍場鎮(zhèn)大屯村、貴州省普安縣地瓜鎮(zhèn)地瓜村、貴州省普安縣青山鎮(zhèn)海馬莊村聚為一類(圖3)。

圖3 不同產(chǎn)地紫雀花聚類分析Fig.3 Cluster analysis of Parochetus communis from different origin

4 結(jié)論

大量研究表明，藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累受到環(huán)境的脅迫，且即使是同一種植物，受到不同的環(huán)境脅迫亦會誘導(dǎo)形成和積累不同的次生代謝產(chǎn)物或其次生代謝產(chǎn)物含量差異明顯。因此，不同產(chǎn)地的紫雀花中3種藥效成分出現(xiàn)了含量差異性。紫雀花中3種藥效成分中美迪紫檀素含量(0.23～1.2 mg/g)明顯高于其他兩種化合物，其含量也高于其他豆科植物中美迪紫檀素的含量，如雞血藤中美迪紫檀素含量范圍為0.065～0.585 mg/g[15]，黃芪中美迪紫檀素含量范圍0.034～0.135 mg/g[16]，紅芪中美迪紫檀素含量范圍0.029～0.353 mg/g[17]。由此可見，由于美迪紫檀素具有抗真菌、細(xì)菌、抗腫瘤等藥理活性[12-14]，其可以作為美迪紫檀素的重要來源藥用植物。

相關(guān)性分析和線性回歸分析表明芒柄花素和芒柄花苷之所以產(chǎn)生顯著性關(guān)系的原因可能是在黃酮類化合物生物合成途徑過程中，芒柄花素是芒柄花苷的生物合成前體，因此，當(dāng)芒柄花素積累得越多的時候，則芒柄花苷也會隨之增多。本研究初步分析紫雀花中3種藥效成分與海拔之間的相關(guān)性關(guān)系，雖未呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性，但總體看來，高海拔均不利于3種藥效成分的代謝積累，特別是芒柄花苷受海拔的影響較大，另據(jù)文獻(xiàn)報道[2]，紫雀花多分布在海拔2 000 m左右地區(qū)，但本次調(diào)查采樣發(fā)現(xiàn)，該植物在1 500 m左右海拔分布較廣，為此，建議在新版的植物志或其他相關(guān)文獻(xiàn)中將紫雀花的分布海拔修正為1 000 m以上比較合適。鑒于環(huán)境因子的多樣性，將會進(jìn)一步收集不同產(chǎn)地的氣溫、降水量、日照強(qiáng)度等因素做主成分分析及冗余分析，以明確影響紫雀花中藥效成分含量的主要環(huán)境因子。