李 武，王國建，閆 歡，賈寶遷

1.中國石化 石油勘探開發(fā)研究院 無錫石油地質(zhì)研究所，江蘇 無錫 214126；2.中國石化 西北油田分公司 勘探開發(fā)研究院，烏魯木齊 830011；3.中國科學(xué)院 微生物研究所，北京 100101

油氣微生物勘探技術(shù)以烴類向地表垂直運(yùn)移為理論基礎(chǔ)，通過研究近地表土壤層中微生物數(shù)量及多樣性特征，從而反映地下深部油氣藏的分布，該技術(shù)可作為油氣勘探的重要輔助手段[1-11]。檢測地表油氣微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)異常的方法，主要包括傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法、分子生物學(xué)技術(shù)以及高通量測序技術(shù)，近年來相關(guān)技術(shù)已在準(zhǔn)噶爾盆地、塔里木盆地、四川盆地、柴達(dá)木盆地和松遼盆地等多個(gè)勘探區(qū)進(jìn)行了生產(chǎn)應(yīng)用，取得了很好的成效[12-17]。

于奇地區(qū)是塔里木盆地塔河油區(qū)外圍重要的油氣勘探地區(qū)[18]。油氣源對(duì)比結(jié)果表明，該區(qū)油氣來源與塔河主體區(qū)一致，主要來源于海相烴源巖。根據(jù)該區(qū)具體的油氣地質(zhì)條件和鄰區(qū)勘探情況綜合分析，于奇地區(qū)具備形成油氣藏的地質(zhì)條件，具有較大的勘探潛力。其中于奇西部地區(qū)鉆探的YQ3，YQ4，YQ5等井相繼在三疊—白堊系3個(gè)油組中獲得油氣發(fā)現(xiàn)，更說明于奇地區(qū)油氣成藏條件優(yōu)越，具有良好的油氣勘探潛力[18-20]。在于奇東部地區(qū)，YQ8井區(qū)奧陶系油氣藏是以巖溶縫洞型儲(chǔ)集體控制的彈性+水驅(qū)動(dòng)的凝析氣藏。YQD1井區(qū)與YQ8井區(qū)相鄰，具有相似的構(gòu)造背景和油氣成藏地質(zhì)條件，處于油氣運(yùn)移聚集的有利地區(qū)，而YQD1井至YQ8井目標(biāo)區(qū)的油氣勘探開發(fā)程度相對(duì)較低[18-20]。因此，本文采用16S rRNA高通量測序技術(shù)，研究于奇地區(qū)微生物物種豐度、多樣性、群落結(jié)構(gòu)等特征，并探索于奇地區(qū)潛在的油氣指示菌，同時(shí)也初步分析了YQD1井至YQ8井勘探目標(biāo)的油氣富集點(diǎn)，為于奇東部地區(qū)油氣勘探提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

于奇地區(qū)位于塔里木盆地塔克拉瑪干沙漠北緣，土壤多數(shù)為風(fēng)沙土，十分干燥，地表植被稀疏，生物作用微弱，有機(jī)物質(zhì)累積較少，而且人為活動(dòng)不多，因此，人類活動(dòng)和環(huán)境對(duì)土壤微生物的影響較小，適于開展油氣微生物的研究工作。研究區(qū)土壤樣品采集部署如圖1所示。YQ5井東部為已知區(qū)(紅色框)，部署采樣點(diǎn)9個(gè)(YQC1，2，3，6，8，9，11，14，16)，命名為YQ-y；YQ12井西部為目標(biāo)區(qū)(藍(lán)色框)，部署采樣點(diǎn)11個(gè)(YQC24—34)，命名為YQ-wz，兩組樣品共20個(gè)。采樣點(diǎn)間距為500 m，每個(gè)采樣點(diǎn)用取土鉆鉆取地表90 cm深度的土壤200 g，采樣完成后用無菌袋密封，放入低溫儲(chǔ)藏箱保存，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行土壤微生物種群結(jié)構(gòu)多樣性分析[21-22]。

圖1 塔里木盆地于奇地區(qū)樣品采樣分布

1.2 土壤微生物總DNA提取及高通量測序

稱取0.5 g土壤樣品，按照FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，美國)操作手冊(cè)提取土壤中微生物總DNA，并測定濃度和質(zhì)量檢測。DNA樣品委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺(tái)進(jìn)行16S rRNA V4區(qū)測序，擴(kuò)增引物使用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)與806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[21-22]。擴(kuò)增條件為：95 ℃，3 min，(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s)30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收和定量后進(jìn)行高通量測序。獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、過濾、拼接、參考序列比對(duì)，最終獲得優(yōu)化序列?；趦?yōu)化序列進(jìn)行可操作分類單元(OTU)聚類分析和物種分類學(xué)注釋，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品注釋到各分類水平上的序列數(shù)目，明確各分類水平的整體注釋情況。基于OTU聚類結(jié)果進(jìn)行多樣性分析、物種群落結(jié)構(gòu)分析和物種差異分析[23-28]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 土壤中微生物OTU差異性比較

近地表土壤層中微生物組成可預(yù)測下伏油氣藏的存在。為研究于奇地區(qū)土壤樣品的微生物物種多樣性等特征，以及YQ-y和YQ-wz兩組的微生物有無差別，將于奇地區(qū)20個(gè)土壤樣品進(jìn)行高通量測序，基于97%的序列相似性將序列聚類成為可操作分類單元，最終獲得了1 691種可分類的操作單元(OTU)。結(jié)果顯示，兩組土壤中所含微生物類群都很豐富，其中YQ-y和YQ-wz兩組中共有的OTU種類1 426種，YQ-y中特有的OTU種類112種，YQ-wz中特有的OTU種類153種，兩組土壤樣品在整體水平上差異不明顯，微生物類群具有相似性(圖2)。

圖2 塔里木盆地于奇地區(qū)土壤樣品中微生物OTU韋恩圖

2.2 土壤中微生物群落α多樣性分析

在發(fā)現(xiàn)YQ-wz和YQ-y兩組的物種組成具有一定的相似性、差異很小之后，進(jìn)一步從整體群落角度全面研究和比較YQ-y和YQ-wz兩組樣品的α多樣性特征，其中包括反映樣本測序深度的實(shí)際OTU數(shù)(數(shù)值越高，表明樣品物種豐富度越高)、物種豐富度指數(shù)Chao1(數(shù)值越大，代表樣本中所含物種越多)、綜合體現(xiàn)物種豐度和均勻度的多樣性指數(shù)(香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù))等(圖3)。從實(shí)際OTU數(shù)和Chao1指數(shù)結(jié)果判斷，YQ-wz組樣品中細(xì)菌數(shù)量、物種數(shù)均高于YQ-y組樣品，香農(nóng)指數(shù)說明YQ-wz組樣品群落多樣性高于YQ-y組樣品，而辛普森指數(shù)在兩組中差異不明顯。

圖3 塔里木盆地于奇地區(qū)土壤樣品YQ-y和YQ-wz兩組樣品α多樣性指數(shù)

2.3 土壤微生物群落的β多樣性分析

生態(tài)系統(tǒng)中菌群各成員發(fā)揮功能受到各自臨近的菌種以及環(huán)境因素影響。為了進(jìn)一步研究YQ-y和YQ-wz兩組樣品的群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用物種群落間的距離來評(píng)估樣本間物種群落的差異程度，即β多樣性分析。本文以主成分分析和非度量多維尺度分析結(jié)果進(jìn)行展示。

主成分分析是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法[29]，YQ-y和YQ-wz兩組的主成分分析結(jié)果見圖4。YQ-y和YQ-wz兩組樣品，組內(nèi)和組間樣品的距離都很接近，除了YQC27和YQC30樣品點(diǎn)，其他各組樣品點(diǎn)都能聚集，說明整體上兩組的群落組成具有相似性，個(gè)別樣品點(diǎn)特殊。

圖4 塔里木盆地于奇地區(qū)土壤樣品中細(xì)菌群落主成分分析

為了更進(jìn)一步反映YQ-y和YQ-wz兩組樣品組間的細(xì)菌群落構(gòu)成情況，采用非度量多維尺度分析，該分析是一種簡化的以低維空間反映多維空間樣本之間關(guān)系的數(shù)據(jù)分析方法，并用點(diǎn)的形式展示在二維平面圖中，點(diǎn)與點(diǎn)的距離代表樣品之間的差異程度(圖5)。結(jié)果顯示，除YQ-y三個(gè)樣品點(diǎn)，其他樣品點(diǎn)的差異程度較小，也說明整體上兩組的群落組成是相似的。

圖5 塔里木盆地于奇地區(qū)樣品微生物群落組成非度量多維尺度分析

2.4 不同分類水平下土壤微生物的差異

上述結(jié)果表明兩組樣品整體微生物類群差異不大，但各樣本在某一分類學(xué)水平上含有的微生物種類及其相對(duì)豐度(所占比重)可能存在差異，而不同物種的豐度也是反映含油氣性以及油氣指示菌的重要方式。為了研究于奇地區(qū)兩組樣本的物種分布以及物種豐度信息，綜合統(tǒng)計(jì)了各樣品的OTU聚類和注釋結(jié)果，匯總每個(gè)樣品注釋到門和屬分類水平上的序列數(shù)目，由此了解兩組樣品在門和屬分類水平的整體注釋情況。

根據(jù)物種注釋結(jié)果，首先選取于奇地區(qū)兩組樣品在門水平豐度排名前10的物種，以疊加柱形圖直觀展示各物種在門水平所占比例(圖6)。結(jié)果顯示，于奇兩組土壤樣品中相對(duì)豐度排名前10的優(yōu)勢細(xì)菌分別為放線菌門(Actinobacteria)，變形菌門(Proteobacteria)，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，綠彎菌門(Chloroflexi)，厚壁菌門(Firmicutes)，廣古菌門(Euryarchaeota)，浮霉菌門(Planctomycetes)，酸桿菌門(Acidobacteria)，疣微菌門(Verrucomicrobia)。其中，YQ-y組的芽單胞菌門(灰色)和擬桿菌門(黃色)比例較高，YQ-wz組的變形菌門(橘色)和綠彎菌門(淺藍(lán))比例較高，而且兩組中均有大量的未知菌門，說明兩組樣品的微生物資源非常豐富；而且許多已知的油氣指示菌屬于芽單胞菌門和變形菌門，提示YQ-wz組樣品含有油氣的可能性很大。特別是YQC-30樣品點(diǎn)，雖然在主成分分析(PCA分析)中差異較大，但其含有非常高豐度的變形菌門，可能存在油氣指示菌，需要進(jìn)一步分析其含油氣性。

圖6 塔里木盆地于奇地區(qū)土壤樣本中門水平物種相對(duì)豐度

為深入研究于奇地區(qū)土壤樣品中微生物相對(duì)豐度，明確是否存在油氣指示菌，又進(jìn)一步比較了兩組樣品中微生物在屬水平相對(duì)豐度(圖7)，發(fā)現(xiàn)于奇地區(qū)有大量的未知細(xì)菌，占土壤細(xì)菌總數(shù)的80%以上，說明于奇地區(qū)微生物資源豐富。于奇土壤樣品中在屬水平比例較高的菌主要是噬甲基菌屬(Methylophaga)，擬桿菌屬(Bacteroides)，類諾卡氏菌屬 (Nocardioides)，糞桿菌屬(Faecalibacterium)，普雷沃氏菌屬9(Prevotella9)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)，鹽單胞菌屬(Halomonas)，嗜鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)，海桿菌屬(Marinobacter)等，其中噬甲基菌屬、擬桿菌屬、類諾卡氏菌屬和芽孢桿菌屬都是能夠利用輕烴為碳源的油氣指示菌[24]。而且類諾卡氏菌屬在順北和新和已知油氣地區(qū)也檢測到并作為油氣指示菌[16-17]。在這兩組中，YQ-y組比例最高的菌屬是擬桿菌屬和類諾卡氏菌屬，分別為2.978%和2.767%；YQ-wz組比例最高的菌屬為噬甲基菌屬和擬桿菌屬，比例為2.191%和1.727%。兩組中既有相同優(yōu)勢的油氣微生物擬桿菌屬，又有各自單獨(dú)優(yōu)勢的油氣微生物噬甲基菌屬和類諾卡氏菌屬。具體到不同樣品，YQ-wz組YQC26和YQC29兩個(gè)樣品含有的已知油氣指示菌較少，含油氣的可能性較小。YQC28和YQC30兩個(gè)樣品含有的擬桿菌屬和噬甲基菌屬的比例最高，含油氣的可能性很大。

圖7 塔里木盆地于奇地區(qū)YQ-y和YQ-wz兩組土壤樣品中屬水平物種相對(duì)豐度

基于以上結(jié)果分析，兩組樣品在門和屬水平的微生物物種豐度差異不大。為了進(jìn)一步說明樣品間相似性，在屬水平選取微生物豐度前50，進(jìn)行聚類熱圖分析(圖8)，以顏色變化與相似程度來反映于奇油氣區(qū)與未知區(qū)在屬水平上群落組成的相似性和差異性。通過聚類熱圖，發(fā)現(xiàn)兩組樣品聚類明顯，特別是YQC25、YQC2和YQC9(YQX1井)，而且擬桿菌屬這種油氣指示菌的比例都較高。說明YQ-wz和YQ-y兩組的物種豐度具有一定的相似性，YQ-wz中YQC25樣品點(diǎn)含油氣的可能性高。

圖8 塔里木盆地于奇地區(qū)樣品點(diǎn)物種屬水平豐度聚類熱圖

整體而言，YQ-y和YQ-wz兩組樣品的微生物物種豐度、分布、群落結(jié)構(gòu)等特征具有相似性，差異較小。采用不同的分析方法，有個(gè)別樣品點(diǎn)的微生物特征存在差異，PCA分析發(fā)現(xiàn)YQC27和YQC30兩個(gè)樣品點(diǎn)不聚類，非度量多維尺度分析(NMDS)發(fā)現(xiàn)YQC27樣品點(diǎn)群落組成差異較大。以YQ-y組樣品為油氣已知區(qū)綜合分析YQ-wz組樣品點(diǎn)，除YQC31和YQC34樣品點(diǎn)與YQ-y組樣品差異較大以外，其他樣品點(diǎn)與YQ-y組樣品種群結(jié)構(gòu)相似，含油氣的可能性都很高，需要結(jié)合地質(zhì)資料和化探手段綜合分析評(píng)估；YQC31和YQC34兩個(gè)土壤樣品含油氣的可能性相對(duì)較小，這有待進(jìn)一步深入分析和研究以確定其含油氣性。

3 結(jié)論和討論

(1)塔里木盆地于奇地區(qū)于奇西(YQ-y)和于奇東(YQ-wz)兩組樣品中所含微生物均很豐富，且共有OTU種類占絕對(duì)優(yōu)勢。YQ-wz組所包含的OUT種類、物種數(shù)和α多樣性略高于YQ-y組。β多樣性分析發(fā)現(xiàn)兩組中多數(shù)樣品點(diǎn)均能夠聚類，僅個(gè)別樣品點(diǎn)差異較大。

(2)于奇兩組樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)具有相似性，在門水平豐度由高到低依次為：放線菌門、變形菌門、芽單胞菌門和擬桿菌門。在屬水平豐度由高到低依次為：噬甲基菌屬、擬桿菌屬、類諾卡氏菌屬、芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬、鹽單胞菌屬、嗜鹽芽孢桿菌和海桿菌屬，其中噬甲基菌屬、類諾卡氏菌屬和芽孢桿菌屬是可利用烷烴兼性生長的常見微生物。此外，于奇兩組樣品蘊(yùn)含大量的未知微生物資源，未知微生物相對(duì)豐度占比80%以上。

(3)將細(xì)菌16S rRNA高通量測序技術(shù)應(yīng)用于塔里木盆地于奇勘探區(qū)，初步掌握了該地區(qū)土壤微生物物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)等特征。在今后研究中需進(jìn)一步結(jié)合地質(zhì)資料，考慮地表環(huán)境差異因素，增加油氣井上方微生物分析數(shù)據(jù)，建立規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的油氣微生物數(shù)據(jù)庫，促進(jìn)微生物勘探技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用。