黃欣媛，鄒禮平，范紅波

(1.湖北工程學(xué)院湖北省植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖北孝感 432000；2.湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，湖北孝感 432000)

PA1b(pea albumin 1 subunit b，豌豆白蛋白1b，又名豌豆胰島素、aglycin)是在豌豆種子中分離鑒定出的一種由37個(gè)氨基酸殘基組成的小分子活性肽，在其他豆科植物中有多種同源異構(gòu)體廣泛存在。它們分子內(nèi)均含有3對(duì)二硫鍵，形成高度緊湊的空間結(jié)構(gòu)，因而性質(zhì)非常穩(wěn)定，耐殺菌劑變性，也不被胃蛋白酶和胰蛋白酶降解。PA1b具有抗蟲活性，能殺死象鼻蟲、蚜蟲、蚊蟲等害蟲，而對(duì)蜜蜂等益蟲無(wú)害，有望開發(fā)成新型生物殺蟲劑。PA1b還能改善糖尿病模型鼠的糖脂代謝，具有開發(fā)成口服降糖多肽藥物的潛力。

基于PA1b在農(nóng)業(yè)病蟲害防治和糖尿病藥物開發(fā)中的潛力，大量獲取PA1b蛋白，進(jìn)行工業(yè)規(guī)模應(yīng)用或深入研究其作用機(jī)制就顯得十分必要。雖然可通過(guò)從豆科植物種子中提取純化來(lái)制備PA1b，但需避免同源異構(gòu)體混入、操作繁瑣、成本高且產(chǎn)量低下，最理想的還是通過(guò)基因工程技術(shù)將PA1b在異源系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。目前，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)小片段的基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，以提高其蛋白表達(dá)量的方法已成功應(yīng)用于多種小分子肽的原核表達(dá)制備，被證實(shí)簡(jiǎn)便且有效。本研究利用同尾酶法構(gòu)建了多拷貝串聯(lián)基因，置于表達(dá)載體pET32a(+)上，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，并用腸激酶對(duì)融合標(biāo)簽和串聯(lián)體進(jìn)行切割，獲得重組PA1b多肽，為PA1b工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET32a(+)、大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶(Ⅰ、H Ⅰ和Ⅱ)、TDNA連接酶，購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；小量質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、SanPCR擴(kuò)增試劑盒、異丙基硫代---半乳糖苷(IPTG)、Bradford蛋白定量試劑、蛋白質(zhì)Marker、Ni-NTA瓊脂糖親和純化樹脂預(yù)裝柱、腸激酶(帶His標(biāo)簽)，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；超濾管、透析袋為Millipore產(chǎn)品；其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PCR儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；超微量分光光度計(jì)，美析(中國(guó))儀器有限公司；核酸蛋白檢測(cè)儀、核酸電泳儀、垂直電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 PA1b基因合成和載體設(shè)計(jì)

由圖1可知，將PA1b的氨基酸序列(A S C N G V C S P F E M P P C G S S A C R C I P V G L V V G Y C R H P S G)按照大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，轉(zhuǎn)變成DNA序列，同時(shí)在5′端添加“HⅠ酶切位點(diǎn)(GGATCC)+腸激酶酶切位點(diǎn)(GACGACGACGACAAG)”，3′端添加“Ⅱ酶切位點(diǎn)(AGATCT)+腸激酶酶切位點(diǎn)(GACGACGACGACAAG)+Ⅰ酶切位點(diǎn)(C T C G A G)”，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成該基因片段并置于pUC57載體上，命名為pUC57-1PA1b。該序列中，HⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)是為了使用雙酶切將基因片段亞克隆到表達(dá)載體pET32a(+)上；HⅠ和Ⅱ酶切位點(diǎn)是為了使用同尾酶法構(gòu)建串聯(lián)重組載體；腸激酶酶切位點(diǎn)是為了在融合蛋白分離純化以后使用腸激酶進(jìn)行特異性切割，將硫氧還蛋白(Trx A)、6×His等標(biāo)簽去除，同時(shí)也將串聯(lián)的PA1b剪切成單個(gè)多肽單元。

1.4 重組表達(dá)載體pET32a(+)-nPA1b的構(gòu)建

首先，采用同尾酶法構(gòu)建PA1b串聯(lián)多拷貝重組質(zhì)粒pUC57-(=2，3，4)，方法見圖2，重復(fù)該過(guò)程，可依次獲得基因串聯(lián)重復(fù)2、3、4次的重組質(zhì)粒。分別采用CaCl法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆的正確性。

其次，將pUC57-載體上的基因片段亞克隆至表達(dá)載體pET32a(+)上。方法是將驗(yàn)證后得到的pUC57-質(zhì)粒(=1，2，3，4)采用HⅠ與Ⅰ雙酶切切下串聯(lián)基因片段，膠回收該片段，與同樣雙酶切純化后的pET32a(+)載體片段按照摩爾濃度比8∶1混合，TDNA連接酶16 ℃過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物用CaCl法轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)大腸桿菌，從含氨芐青霉素的LB平板上挑取菌落進(jìn)行培養(yǎng)，小量抽提質(zhì)粒，以pET32a(+)質(zhì)粒上多克隆位點(diǎn)上游的通用引物SoTag primer(G A A C G C C A G C A C A T G G A C A G C)和下游的通用引物T7 terminator primer(G C T A G T T A T T G C T C A G C G G)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET32a(+)-(=1～4)。

1.5 重組PA1b的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取含pET32a(+)-的大腸桿菌單菌落，接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，再按100倍稀釋比例轉(zhuǎn)接至新鮮含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至為0.6時(shí)，加入1 mmol/L的IPTG，25 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h。同時(shí)，設(shè)置1組pET32a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌作為對(duì)照組。

1.6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)

誘導(dǎo)結(jié)束后，4 ℃離心收集菌體，PBS洗滌2次，PBS重懸后冰浴中進(jìn)行超聲破壁(功率400 W，總時(shí)間20 min，工作2 s，間隔6 s)，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清，將沉淀用包涵體溶解液(8 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，0.1% Triton X-100，pH值8.0)溶解。Bradford法測(cè)定上清和包涵體溶解液的總蛋白濃度，取25 μg總蛋白上樣，進(jìn)行12%分離膠的SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色，凝膠成像儀記錄電泳圖譜。分析PA1b融合蛋白的可溶性，采用ImageJ v1.52圖像軟件分析條帶的光密度，計(jì)算PA1b蛋白的相對(duì)含量。

1.7 PA1b融合蛋白的親和純化

按“1.5”節(jié)和“1.6”節(jié)方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和菌體破碎，離心收集包涵體，包涵體用柱平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，8 mol/L尿素，pH值8.0)重溶后通過(guò) Ni-NTA 瓊脂糖樹脂柱進(jìn)行親和層析純化。進(jìn)樣前，利用2倍柱體積的平衡緩沖液平衡柱子。進(jìn)樣后，采用5～10倍柱體積的平衡緩沖液清洗柱子，直至流穿液的接近基線。最后采用2～5倍柱體積的洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，8 mol/L尿素，pH值8.0)洗脫帶有6×His標(biāo)簽的PA1b融合蛋白。透析去除咪唑和尿素，超濾管離心濃縮獲得PA1b融合蛋白。

1.8 融合蛋白的腸激酶酶切和純化

將純化的PA1b融合蛋白置于腸激酶酶切緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，2 mmol/L CaCl，pH值7.6)，按照50 μg融合蛋白加1U腸激酶的用量在16 ℃酶切36 h。酶切后的混合液再次進(jìn)行Ni-NTA瓊脂糖樹脂親和層析純化，切下的Trx-His標(biāo)簽和帶有His標(biāo)簽的腸激酶結(jié)合到鎳柱上，而PA1b多肽存在于流穿液中。收集流穿液，采用截留量10 ku超濾管純化PA1b多肽，PA1b多肽在超濾管離心后的透過(guò)液中，進(jìn)行Tricine SDS-PAGE檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體pET32a(+)-nPA1b的構(gòu)建

PA1b由111 bp DNA序列編碼，在基因合成時(shí)兩端分別添加了HⅠ和Ⅱ的酶切序列，由圖2可知，采用同尾酶法構(gòu)建了串聯(lián)重復(fù)序列載體pUC57-(=2，3，4)，再亞克隆至表達(dá)載體pET32a(+)上，構(gòu)建成pET32a(+)-(圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取陽(yáng)性克隆，采用SoTag和T7 terminator引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增插入片段，由圖3可知，顯示擴(kuò)增出的條帶與目標(biāo)片段預(yù)期大小(PA1b單拷貝320 bp，二拷貝452 bp，三拷貝 584 bp，四拷貝716 bp)一致。進(jìn)而進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)插入片段的插入位置正確，且序列與理論設(shè)計(jì)完全一致，說(shuō)明多拷貝PA1b基因串聯(lián)載體構(gòu)建成功。

2.2 PA1b融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析

IPTG誘導(dǎo)pET32a(+)-宿主菌表達(dá)后，超聲破碎菌體，SDS-PAGE分析破碎組分的上清和沉淀部分，由圖4可知，相對(duì)于空載體對(duì)照，pET32a(+)-菌體裂解液上清和沉淀部分均明顯多出1個(gè)約38 ku條帶，和4拷貝串聯(lián)PA1b融合蛋白理論分子量相符，說(shuō)明融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功，且主要表達(dá)在包涵體中。

2.3 不同拷貝數(shù)PA1b融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

采用IPTG分別對(duì)含1～4串聯(lián)重復(fù)基因pET32a(+)-質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，由圖5可知，1～4拷貝數(shù)PA1b融合蛋白的理論分子量分別約為25.2、29.4、33.6、37.8 ku，研究觀察到各融合蛋白分子量與理論分子量相符，說(shuō)明pET32a(+)-(=1，2，3，4)原核表達(dá)載體均能成功誘導(dǎo)表達(dá)。采用Image J軟件對(duì)各泳道進(jìn)行光密度分析，由表1可知，發(fā)現(xiàn)各拷貝數(shù)PA1b融合蛋白在包涵體總蛋白中的相對(duì)含量有差異，換算成PA1b的相對(duì)含量也有差異。理論上，質(zhì)粒中基因拷貝數(shù)越多，與載體質(zhì)量比越大，PA1b在融合蛋白中的含量就越高。根據(jù)圖5中融合蛋白實(shí)際表達(dá)水平進(jìn)行換算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pET32a(+)-表達(dá)產(chǎn)物中PA1b的相對(duì)含量最高(23.3%)，約為單拷貝(5.5%)的4.2倍，因此在后續(xù)的融合蛋白分離純化和酶切試驗(yàn)中均選用pET32a(+)-菌株作為誘導(dǎo)表達(dá)菌。3拷貝和4拷貝串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物中PA1b的相對(duì)含量幾乎相同，說(shuō)明蛋白表達(dá)量和拷貝數(shù)之間并非線性正相關(guān)。

表1 pET32a(+)-nPA1b表達(dá)融合蛋白水平及其中PA1b相對(duì)含量

2.4 PA1b融合蛋白的純化

將pET32a(+)-的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Ni-NTA柱親和層析純化，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，由圖6可知，發(fā)現(xiàn)分離純化后的4拷貝PA1b融合蛋白具有較高純度(97.8%)。

2.5 PA1b融合蛋白腸激酶酶切

由圖7可知，將純化后的PA1b融合蛋白采用腸激酶酶切，完全酶切后的蛋白混合液經(jīng)過(guò)Ni親和層析純化后，流穿液中得到切開的無(wú)TrxA標(biāo)簽、無(wú)6×His標(biāo)簽的單拷貝PA1b多肽，經(jīng)超濾管濃縮去雜后，Tricin-SDS-PAGE檢測(cè)分子量約為4.5 ku，與理論預(yù)期相符。

3 討論與結(jié)論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有高效、條件易控、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。因此，本研究選用大腸桿菌作為PA1b的表達(dá)宿主。PA1b是一種小分子量多肽，且富含半胱氨酸，因此在進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)，要考慮如何提高蛋白表達(dá)量、促進(jìn)分子內(nèi)二硫鍵的正確形成、保持多肽天然折疊構(gòu)象等因素。本研究采用構(gòu)建串聯(lián)多拷貝基因的策略來(lái)提升表達(dá)量，通過(guò)同尾酶法構(gòu)建了插入1～4串聯(lián)拷貝數(shù)PA1b的重組載體，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析了各融合蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在“1.5”節(jié)中所述的誘導(dǎo)條件下，PA1b融合蛋白主要存在于包涵體中，且多拷貝數(shù)PA1b的表達(dá)量高于單拷貝，4拷貝串聯(lián)PA1b蛋白含量最高，提示串聯(lián)表達(dá)是提高產(chǎn)量的有效方法。然而，拷貝數(shù)并非越多越好，最佳拷貝數(shù)仍取決于載體上串聯(lián)肽與融合標(biāo)簽的相互影響、實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)條件等多種因素。

本研究將串聯(lián)基因插入到具有Trx A、6×His等多個(gè)融合標(biāo)簽的pET32a(+)載體上進(jìn)行融合表達(dá)，Trx A能提供氧化還原動(dòng)力，促進(jìn)PA1b分子內(nèi)二硫鍵形成?？紤]到pET32a(+)載體上標(biāo)簽的去除可采用腸激酶酶切法，所以在構(gòu)建串聯(lián)基因時(shí)，在各拷貝間也添加了腸激酶酶切位點(diǎn)。因此，在融合蛋白親和純化后，采用腸激酶酶切，既可去掉TrxA和6×His融合標(biāo)簽，也能將串聯(lián)的PA1b切割成單體重組PA1b多肽。結(jié)果表明，pET32a(+)-的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)親和純化后可獲得高純度的4拷貝PA1b融合蛋白，再經(jīng)腸激酶酶切、親和層析去雜、超濾濃縮后獲得了不帶TrxA標(biāo)簽的重組PA1b多肽。它比天然PA1b的C末端多了7個(gè)氨基酸殘基：Arg-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，這是否會(huì)對(duì)PA1b的活性造成影響，有待后續(xù)研究。

在PA1b的原核表達(dá)方面，國(guó)內(nèi)外也有報(bào)道。2003年，Hanada等在BL21大腸桿菌中導(dǎo)入leginsulin(PA1b在黃豆中的同源異構(gòu)體，同源性約64%)基因，表達(dá)出帶有Trx標(biāo)簽的leginsulin。2004年，杜雯等將PA1b與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)構(gòu)建成融合基因在大腸桿菌DH5α中進(jìn)行了周質(zhì)空間可溶性表達(dá)，然而融合蛋白的結(jié)構(gòu)過(guò)于龐雜而無(wú)PA1b活性，表達(dá)量太低，及MBP標(biāo)簽去除需經(jīng)Factor Xa酶切成本高，因而并無(wú)后續(xù)。最近，黃敏華等利用內(nèi)含肽與自組裝肽與Aglycin(PA1b別名)連接，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到目標(biāo)蛋白聚集體，再通過(guò)內(nèi)含肽介導(dǎo)的N端自剪切，去掉了融合標(biāo)簽，制備無(wú)標(biāo)簽的Aglycin多肽。

綜上，本研究采用串聯(lián)表達(dá)的方案在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中制備了豆類活性肽PA1b的4拷貝融合蛋白，有效提高了PA1b表達(dá)量。經(jīng)腸激酶切割后，得到了無(wú)標(biāo)簽的單拷貝PA1b重組多肽，為多拷貝法制備PA1b肽奠定了基礎(chǔ)。