武紹龍， 唐 明， 張習(xí)敏， 唐 婧*

( 1. 貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025； 2. 貴州師范大學(xué)， 貴州省植物生理與發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng) 550025； 3. 貴州師范大學(xué)， 國(guó)家林業(yè)和草原局西南喀斯特山地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng) 550025 )

馬纓杜鵑()屬于常綠灌木或小喬木，因其花色鮮艷，形狀酷似馬頭飾的瓔珞而得名，主要分布于西南地區(qū)，包括四川西南部、云南全省和貴州西北部等(張長(zhǎng)芹等，2015)，其中貴州西北部以普底和金坡景區(qū)分布最為廣泛，為主要的建群種和優(yōu)勢(shì)種(李葦潔和陳訓(xùn)，2005)。每年3月中旬前完成初花期(花瓣開始開張到10%花序開放)；3月下旬到4月初進(jìn)入為盛開期(10%花序開放到10%花序出現(xiàn)凋謝)；4月中旬進(jìn)入凋謝期(10%花序出現(xiàn)凋謝到70%花序出現(xiàn)凋謝)，馬纓杜鵑整個(gè)花期為25～30 d。研究馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程中的代謝組分變化，對(duì)延長(zhǎng)和調(diào)節(jié)馬纓杜鵑花期，充分發(fā)揮馬纓杜鵑的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)貴州省地方經(jīng)濟(jì)以及鄉(xiāng)村振興具有極其重要的研究意義。目前，關(guān)于馬纓杜鵑花主要包括花特征和花粉性狀的研究，以百里杜鵑保護(hù)區(qū)馬纓杜鵑為實(shí)驗(yàn)材料研究花特征分化和資源分布情況(胡德美 等，2021)；用顯微鏡觀察馬纓杜鵑花粉形態(tài)大小、外壁紋飾、孔溝形態(tài)等性狀(毛加寧，2000)。同時(shí)，在馬纓杜鵑花花期調(diào)控的研究則主要集中于營(yíng)養(yǎng)元素、植物激素和溫度等處理方法，包括用不同濃度的N、P、K、Ca等營(yíng)養(yǎng)元素處理馬纓杜鵑觀察對(duì)花芽發(fā)育和花期的影響(洪鯤等，2010)；在馬纓杜鵑花芽發(fā)育初期和開花前期噴施外源激素對(duì)始花期、盛開期、末花期和開花數(shù)的影響(宋慶發(fā)等，2010)；通過不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)處理馬纓杜鵑的花蕾，探索馬纓杜鵑花花期調(diào)控方法(岳保超，2015)。目前，僅有少量關(guān)于馬纓杜鵑莖和根代謝物的研究報(bào)道，利用各種色譜技術(shù)從馬纓杜鵑的莖分離鑒定得到10種化合物(徐金金等，2012)，然而馬纓杜鵑花的發(fā)育進(jìn)程中代謝物和代謝物途徑研究尚未見相關(guān)報(bào)道。

近年來(lái)，植物代謝組學(xué)研究已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于分析果樹生長(zhǎng)、發(fā)育、果實(shí)成熟過程中的代謝物變化(Aaron et al., 2008；Zhang et al., 2011；Li et al., 2020)，目前也開始應(yīng)用于研究植物花形成、發(fā)育的代謝機(jī)制研究(賈巖等，2017；程少禹 等，2020)；薛水玉等(2012)采用氣相色譜-質(zhì)譜法技術(shù)分析款冬花不同發(fā)育階段代謝組，發(fā)現(xiàn)款冬花蕾發(fā)育過程中部分特征代謝物呈現(xiàn)顯著變化；He等(2020)利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組研究鐵皮石斛花的發(fā)育機(jī)制，發(fā)現(xiàn)次生代謝和碳水化合物的變化與花的發(fā)育有關(guān)；徐紅霞等(2020)采用GC-MS技術(shù)檢測(cè)枇杷花發(fā)育進(jìn)程中的代謝物質(zhì)，揭示影響花發(fā)育進(jìn)程的生理與代謝機(jī)制。代謝組學(xué)對(duì)植物花的發(fā)育代謝產(chǎn)物及代謝通路研究提供了方法。

本研究以貴州省畢節(jié)市大方縣百里杜鵑風(fēng)景區(qū)為研究區(qū)域，以馬纓杜鵑花為研究對(duì)象。選取花苞期、開裂期、傳粉期、盛開期、衰老期和凋謝期的花為材料，采用非靶向代謝組學(xué)(LC-MS/MS)分析方法，研究馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程中6個(gè)階段的代謝產(chǎn)物及代謝通路，擬探討以下問題：(1)馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程中不同階段代謝物如何變化；(2)分析馬纓杜鵑花差異顯著的代謝物和相關(guān)的代謝通路；(3)篩選出與馬纓杜鵑花發(fā)育相關(guān)的重要代謝物。本研究結(jié)果為馬纓杜鵑花花期調(diào)控提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為貴州省畢節(jié)市大方縣百里杜鵑風(fēng)景區(qū)馬纓杜鵑。

2020年選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致馬纓杜鵑，分別在花苞期(3月20日)、開裂期(3月24日)、傳粉期(3月30日)、盛開期(4月3日)、衰老期(4月10日)、凋謝期(4月15日)，從6株樹上采集適量馬纓杜鵑花樣本，經(jīng)液氮冷凍后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，每個(gè)時(shí)期取6個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本。

1.2 馬纓杜鵑花代謝物提取

基于液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)(Warwick et al., 2011；Want et al., 2010)進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究。取100 mg液氮研磨的馬纓杜鵑花樣本，置于EP管中，加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋震蕩，冰浴靜置5 min，15 000 r·min、4 ℃離心10 min，取100 μL的上清加超純?nèi)ルx子水稀釋至甲醇含量為53%，并置于離心管中15 000、4 ℃離心10 min，收集上清液，進(jìn)樣LC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)分析。

從每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本中取等體積樣本混勻作為(quality control)QC樣本?？瞻讟颖緸楹?.1%甲酸的53%甲醇水溶液代替實(shí)驗(yàn)樣本，前處理過程與實(shí)驗(yàn)樣本相同。

1.3 非靶向代謝組學(xué)(LC-MS/MS)檢測(cè)

采用Thermo Hyperil Gold column色譜柱(C18)，柱溫40 ℃，流速0.2 mL·min。正離子模式：流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為甲醇；負(fù)離子模式：流動(dòng)相A為5mmol醋酸銨(pH 9.0)，流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫(0 ～ 1.5 min，98%A，2%B；1.5 ～ 12 min，100%B；12 ～ 14 min，100%B；14 ～ 14.1 min，98%A，2%B；14.1 ～ 17.0 min，98%A，2%B)。進(jìn)樣量為10 μL。利用Thermo Vanquish UHPLC液相色譜Thermo QE系列質(zhì)譜分別進(jìn)行正、負(fù)離子模式采集。掃描范圍選擇70 ～ 1 050；ESI源的設(shè)置如下：Spray voltage為3.2 kV；Sheath gas flow rate為35 arb；Aux gas flow rate為10 arb；Capillary temp為320 ℃。Polarity：positive；negative；MS/MS二級(jí)掃描為data-dependent scans。每10個(gè)分析樣本進(jìn)行一次QC樣本，評(píng)價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中儀器狀態(tài)的穩(wěn)定性和檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將采集到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入CompoundDiscoverer 3.1(CD)軟件中，通過保留時(shí)間、質(zhì)荷比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，然后根據(jù)保留時(shí)間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5 μg·mL進(jìn)行峰對(duì)齊，隨后根據(jù)質(zhì)量偏差5 μg·mL、信號(hào)強(qiáng)度偏差30%(Dai et al., 2017)等信息進(jìn)行峰提取，同時(shí)對(duì)峰面積進(jìn)行定量，再整合目標(biāo)離子，然后通過分子離子峰和碎片離子進(jìn)行分子式的預(yù)測(cè)并與mzCloud、mzVault和MassList數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，用blank樣本去除背景離子，并對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化，最后得到數(shù)據(jù)的鑒定和定量結(jié)果。

使用MetaX(Wen et al., 2017)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換處理，將所有實(shí)驗(yàn)樣本和QC樣本導(dǎo)入SIMCA14.1軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析(阿基業(yè)，2010)，采用主成分分析(PCA)觀察各樣本的整個(gè)過程的穩(wěn)定性，然后進(jìn)一步使用有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)來(lái)區(qū)分各組間代謝物的差異性。根據(jù)多變量OPLS-DA模型分析中變量權(quán)重(>1)、結(jié)合檢驗(yàn)的值(<0.05)和單變量分析差異倍數(shù)(fold-change，>2或<0.5)篩選差異代謝物。維恩圖由TB tools 0.6軟件完成，代謝通路富集分析基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬纓杜鵑花開花至凋謝過程的形態(tài)變化

將馬纓杜鵑花開花至凋謝過程分為6個(gè)時(shí)期，如圖1所示?；ò?A)：花未開，表現(xiàn)為花苞狀態(tài)，內(nèi)部花藥還未成熟，雄蕊未開裂；開裂期(B)：花苞已經(jīng)初步打開，雄蕊剛開裂，雌蕊柱頭上未有花粉；傳粉期(C)：花苞較為開發(fā)，雄蕊完全裂開，雌蕊柱頭上已經(jīng)結(jié)合覆蓋花粉；盛開期(D)：花朵呈現(xiàn)完全盛開，顏色艷麗，雄蕊已經(jīng)完全開裂，且花粉已經(jīng)全部裂出，雌蕊柱頭上花粉已經(jīng)不多，傳粉受精已完成；衰老期(E)：花朵開始凋謝，出現(xiàn)萎蔫狀態(tài)；凋謝期(F)：花朵完全枯萎、凋謝和萎蔫。

A. 花苞期; B. 開裂期; C. 傳粉期; D. 盛開期; E. 衰老期; F. 凋謝期。A. Bud stage; B. Dehiscence stage; C. Pollination stage; D. Blooming stage; E. Senescence stage; F. Withering stage.圖 1 馬纓杜鵑花開花至凋謝過程的形態(tài)變化Fig. 1 Morphological changes of Rhododendron delavayi from flowering to withering

2.2 馬纓杜鵑花樣本主成分分析

為分析馬纓杜鵑花各個(gè)時(shí)期間代謝組的相互關(guān)系，采用主成分分析(PCA)通過建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行正交變換簡(jiǎn)化降維分析樣本間代謝譜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)關(guān)系。馬纓杜鵑花主成分分析(圖2)表明，不同時(shí)期代謝物各組間存在明顯的分離趨勢(shì)，每個(gè)樣本的數(shù)據(jù)處理結(jié)果可信，每個(gè)樣本之間存在明顯差異，且組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)重疊效果好，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)過程中數(shù)據(jù)組的重現(xiàn)性好，可用于后續(xù)差異代謝物分析。花苞期和開裂期、傳粉期、盛開期代謝物的變化相對(duì)較大，衰老期與凋謝期的代謝物相對(duì)最大。

A. 正離子模式; B. 負(fù)離子模式。 QC. 質(zhì)控樣本; B. 花苞期; PD. 開裂期; P. 傳粉期; AP. 盛開期; S. 衰老期; F. 凋謝期。下同。A. Positive ion mode; B. Negative ion mode. QC. Quality control sample; B. Bud stage; PD. Dehiscence stage; P. Pollination stage; AP. Blooming stage; S. Senescence stage; F. Withering stage. The same below.圖 2 馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程中代謝物PCA模型得分圖Fig. 2 PCA model scores of metabolites from flowering to withering of Rhododendron delavayi

為篩選出馬纓杜鵑開花至凋謝進(jìn)程中的差異代謝物，采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)區(qū)分6個(gè)時(shí)期代謝物的總體差異，結(jié)果如圖3所示。馬纓杜鵑開花至凋謝進(jìn)程中，花苞期、開裂期、傳粉期、盛開期、衰老期、凋謝期6個(gè)時(shí)期的代謝物明顯分離，表明各組樣本代謝物存在顯著性的差異變化。該模型質(zhì)量參數(shù)和均大于0.9，說(shuō)明當(dāng)前OPLS-DA分析模型穩(wěn)定可靠，具有良好的預(yù)測(cè)能力，有利于尋找潛在的馬纓杜鵑開花至凋謝進(jìn)程中的差異代謝物。

圖 3 馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程中代謝物OPLS-DA得分圖Fig. 3 OPLS-DA scores of metabolites from flowering to withering of Rhododendron delavayi

2.3 馬纓杜鵑花代謝物分析

研究馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程中代謝物的變化，采用LC-MS/MS檢測(cè)馬纓杜鵑花6個(gè)時(shí)期的代謝物多峰圖，花苞期代謝物色譜圖見圖4。共檢測(cè)到973種代謝物，正離子模式587種，負(fù)離子模式386種，其中黃酮類114種；有機(jī)酸114種；酚酸類112種；氨基酸及其衍生物75種；脂類61種；生物堿57種；萜類45種；核苷酸及其衍生物43種；糖類及其衍生物36種；苯丙素類33種；醇和多元醇33種；鞣質(zhì)11種；甾體3種；其他類236種。

圖 4 LC-MS/MS代謝物檢測(cè)多峰圖Fig. 4 LC-MS/MS metabolite detection multimodal graph

2.4 差異代謝物分析

根據(jù)OPLS-DA模型的變量重要性投影值篩選馬纓杜鵑花6個(gè)時(shí)期的差異代謝物(>1、<0.05和>2 或<0.5)。從花苞期、開裂期、傳粉期、盛開期、衰老期到凋謝期進(jìn)行相鄰兩個(gè)時(shí)期的代謝組比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：馬纓杜鵑花開花到凋謝進(jìn)程中共有591種差異代謝物。其中，花苞期與開裂期有170種差異代謝物(正離子模式87，負(fù)離子模式83)，48種上調(diào)，122種下調(diào)；開裂期與傳粉期有144種差異代謝物(正離子模式89，負(fù)離子模式55)，68種上調(diào)，76種下調(diào)；傳粉期與盛開期有111種差異代謝物(正離子模式67，負(fù)離子模式44)，75種上調(diào)，36種下調(diào)；盛開期與衰老期有284種差異代謝物(正離子模式184，負(fù)離子模式100)，177種上調(diào)，107種下調(diào)；衰老期與凋謝期有314種差異代謝物(正離子模式180，負(fù)離子模式134)，260種上調(diào)，54種下調(diào)。在馬纓杜鵑花期進(jìn)入衰老期和凋謝期后差異代謝物數(shù)量明顯增多于開花過程，且大部分是表達(dá)量顯著上升的差異代謝物。而在馬纓杜鵑花苞期至開裂期過程中，差異代謝物中大部分的表達(dá)量顯著下調(diào)。差異代謝物維恩圖分析表明(圖5)，絕大部分(≥46.8%)的差異代謝物都只出現(xiàn)在一個(gè)相鄰變化時(shí)期，沒有任何差異代謝物出現(xiàn)在整個(gè)開發(fā)至凋謝過程。

A. 上調(diào)代謝物； B. 下調(diào)代謝物。A. Up-regulated metabolites； B. Down-regulated metabolites.圖 5 馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程中差異代謝物維恩圖Fig. 5 Venn diagram of differential metabolites from flowering to withering of Rhododendron delavayi

2.5 代謝通路分析

通過KEGG Pathway富集分析顯著差異代謝物(Kanehisa & Goto, 2000；Lin et al., 2014)，如圖6所示。注釋到68條代謝通路，顯著代謝通路(<0.05)要有6條，分別是苯丙素類生物合成，植物激素的生物合成，類黃酮生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成鳥氨酸、賴氨酸和煙酸生物堿的生物合成。其中，極顯著的代謝通路(<0.01)包括苯丙素類生物合成、植物激素的生物合成和類黃酮生物合成。

圖 6 馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程中差異代謝物主要代謝通路富集分析Fig. 6 Enrichment analysis of main metabolic pathways of differential metabolites from flowering to withering of Rhododendron delavayi

本研究根據(jù)代謝組學(xué)分析差異代謝物與代謝通路的關(guān)系，挖掘與馬纓杜鵑花開花至凋謝相關(guān)的差異代謝物，推測(cè)代謝物可能的作用機(jī)制。結(jié)合代謝通路圖(圖7)，共篩選到10種差異代謝物，包括苯丙氨酸(L-phenylalanine)、反式肉桂酸(-cinnamic acid)、 查耳酮 (chalcone)、 柚皮素(naringenin)、對(duì)香豆酰基莽草酸(-coumaroyl shikimic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、松柏醇(coniferyl alcohol)、芥子酸(sinapic acid)、紫丁香苷(syringin)、槲皮素(quercetin)。在馬纓杜鵑花的6個(gè)時(shí)期，代謝物含量表達(dá)如圖6所示，苯丙素類生物合成相關(guān)的差異代謝物包括苯丙氨酸、反式肉桂酸、對(duì)香豆酰莽草酸、松柏醇、芥子酸、紫丁香苷在衰老期(S)和凋謝期(F)兩個(gè)時(shí)期均為上調(diào)表達(dá)，特別是在凋謝期(F)達(dá)到最高值；而黃酮類生物合成相關(guān)的代謝物柚皮素、槲皮素和查爾酮隨著花的生長(zhǎng)發(fā)育含量呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。在‘夏黑’葡萄二季果冬芽分化關(guān)鍵時(shí)期，CCC處理會(huì)誘導(dǎo)苯丙素合成和類黃酮合成通路中部分基因的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，通過改變與成花相關(guān)的基因表達(dá)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成和代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)成花(時(shí)曉芳等，2021)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析不同發(fā)育階段款冬葉，發(fā)現(xiàn)葉片生長(zhǎng)發(fā)育的過程中苯丙素類生物合成相關(guān)基因表達(dá)量不斷增多(聶佳慧等，2018)。馬纓杜鵑花開花至代謝進(jìn)程中苯丙素類代謝物表達(dá)量逐漸升高，而黃酮類代謝物表達(dá)量逐漸降低，苯丙素類和黃酮類代謝物表達(dá)可能與馬纓杜鵑花發(fā)育有關(guān)。

圖 7 苯丙素類、黃酮類等有效成分生物合成通路Fig. 7 Biosynthesis pathway of active components about phenylpropanes and flavones

3 討論與結(jié)論

3.1 馬纓杜鵑花差異代謝物

代謝物是生物體表型的基礎(chǔ)，能幫助我們更直觀有效地了解生物學(xué)過程及其機(jī)理(熊歡歡等，2019；霍冬敖等，2021)。采用GC-MS技術(shù)對(duì)枇杷花整個(gè)發(fā)育進(jìn)程中代謝物質(zhì)分析，C/N含量比是決定花發(fā)育進(jìn)程的重要因素之一(徐紅霞等，2020)。長(zhǎng)期以來(lái)馬纓杜鵑花花期調(diào)控一直都是研究熱點(diǎn)，馬纓杜鵑花的開花至凋謝進(jìn)程是十分復(fù)雜的生理過程，該過程可能與代謝物種類和含量密切相關(guān)。本研究采用非靶向代謝組學(xué)方法，研究馬纓杜鵑花開花至凋謝的6個(gè)時(shí)期(花苞期、開裂期、傳粉期、盛開期、衰老期和凋謝期)代謝物變化。通過代謝組學(xué)分析，共篩選獲得591種差異表達(dá)代謝物，主要包括黃酮類、有機(jī)酸、酚酸類、氨基酸，及其衍生物、脂質(zhì)和生物堿等，這些差異代謝物在花的生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)情況不相同，隨著馬纓杜鵑花的生長(zhǎng)發(fā)育差異代謝物在花苞期至盛開期逐漸減少，進(jìn)入衰老期和凋謝期后顯著增加；而上調(diào)代謝物在整個(gè)開花至凋謝進(jìn)程中逐漸增加，并且在凋謝期達(dá)到最大值；下調(diào)代謝物則在花苞期至盛開期逐漸減少，衰老期增加，凋謝期減少。本研究表明，馬纓杜鵑花的不同發(fā)育階段差異代謝物種類和表達(dá)可能與花的開花至凋謝進(jìn)程密切相關(guān)。

3.2 馬纓杜鵑花差異代謝通路

基于KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物富集分析，注釋到68條代謝通路，其中3條極顯著的代謝通路(< 0.01)分別是苯丙素類生物合成、植物激素的生物合成和類黃酮生物合成。其中，苯丙素類生物合成是最顯著的代謝通路，苯丙氨酸為下游次生代謝產(chǎn)物提供原料。本研究基于苯丙素類、黃酮類等有效成分生物合成通路共篩選獲得10種有效成分生物合成有關(guān)的差異代謝物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，苯丙素類生物合成相關(guān)的代謝物表達(dá)量同馬纓杜鵑花的其他時(shí)期相比，在衰老期和凋謝期代謝物表達(dá)量逐漸升高，而黃酮類生物合成相關(guān)的代謝物隨著花的生長(zhǎng)發(fā)育含量呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，這些代謝物可能對(duì)馬纓杜鵑花凋謝有重要調(diào)控作用。在馬纓杜鵑花的花苞期苯丙氨酸表達(dá)量相對(duì)較低，隨著花的生長(zhǎng)發(fā)育代謝物表達(dá)量逐漸升高，代謝通路上相關(guān)代謝也發(fā)生相應(yīng)變化，說(shuō)明它對(duì)整個(gè)代謝通路的完成具有重要調(diào)控作用。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，苯丙素類生物合成是最重要的植物次生代謝途徑之一(Dong & Lin, 2021)，植物的苯丙素類生物合成代謝途徑及其分支途徑會(huì)產(chǎn)生許多次生代謝產(chǎn)物，如色素、酚酸、黃酮、類黃酮、木質(zhì)素等(文歡等，2017)?？疃ú煌L(zhǎng)發(fā)育階段的次生代謝物代謝組成明顯不同，苯丙素類代謝物在發(fā)育初期至中后期表達(dá)量較高；黃酮類代謝物在發(fā)育的各個(gè)階段表達(dá)量均有波動(dòng)，但總體變化不大，次生代謝物累積促進(jìn)花的發(fā)育(賈巖等，2017)。采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)川佛手不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)苯丙素生物合成中7個(gè)相關(guān)基因隨著果實(shí)的發(fā)育及變色呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)，提高其表達(dá)從而促進(jìn)果實(shí)發(fā)育(潘媛等，2020)。苯丙素類生物合成途徑的前端苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，再由肉桂酸羥化酶(C4H)產(chǎn)生對(duì)羥基香豆酸，再經(jīng)4-香豆酰-CoA 連接酶(4CL)催化生成4-香豆酸CoA，進(jìn)一步向下游特異性合成途徑，轉(zhuǎn)化為不同的苯丙素類代謝產(chǎn)物，包括香豆素、黃酮類、萜類和木質(zhì)素等(王玉等，2019；霍冬敖等，2021)。在馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程中苯丙素類生物合成相關(guān)的差異代謝物苯丙氨酸、反式肉桂酸、對(duì)香豆酰莽草酸、松柏醇、芥子酸、紫丁香苷代謝物隨著花的生長(zhǎng)發(fā)育含量呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，特別是在凋謝期(F)達(dá)到最高值；而黃酮類生物合成相關(guān)的代謝物柚皮素、槲皮素和查爾酮在花的生長(zhǎng)發(fā)育過程中下調(diào)表達(dá)。對(duì)不同發(fā)育時(shí)期大白菜花的轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)花香的主要成分是苯丙素，而黃酮類化合物是花、果實(shí)和種子的主要顯色物質(zhì)，此外它還能影響花瓣的伸長(zhǎng)，促進(jìn)花粉的萌發(fā)(李改珍等，2017)。在苯丙素類生物合成中L-苯丙氨酸(侯思宇等，2015)、柚皮素(Tu et al., 2016)、阿魏酸(Louie et al., 2010)等作為中間體，它們的表達(dá)量高低直接限制到下游代謝途徑的進(jìn)行，從而影響花的開花至凋謝過程。苯丙素類、黃酮類等代謝物作為重要次生代謝產(chǎn)物，推測(cè)其可能為馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程具有重要的調(diào)控作用。更好地了解代謝物的生物合成與馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程中的關(guān)系還需通過進(jìn)一步的深入分子水平研究。

本研究通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)馬纓杜鵑花開花至凋謝進(jìn)程中不同階段的代謝成分進(jìn)行分析，基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行注釋并獲得了相應(yīng)通路，構(gòu)建了馬纓杜鵑花中苯丙素類、黃酮類等有效成分生物合成途徑，為進(jìn)一步研究代謝物的基因調(diào)控作用以及全面解析代謝途徑提供代參考，為延長(zhǎng)馬纓杜鵑花花期調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。