孫浩榮 魏明慧 范曉梅 薛明明

心肌肥厚是指心肌細(xì)胞應(yīng)對(duì)增強(qiáng)的心臟后負(fù)荷而產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，早期這種代償性反應(yīng)有利于維持心臟功能，但長(zhǎng)期持續(xù)的高負(fù)荷狀態(tài)最終會(huì)引起心室重構(gòu)、心功能失代償而發(fā)生心力衰竭甚至心源性猝死[1,2]。因此，預(yù)防和改善心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。

環(huán)氧化酶(COX)有兩種異構(gòu)體COX-1和COX-2，阿司匹林是COX-1和COX-2抑制劑，塞來昔布是COX-2抑制劑。心肌肥厚過程中伴有炎性反應(yīng)發(fā)生，炎性反應(yīng)會(huì)趨化大量炎性細(xì)胞因子[3]。阿司匹林有抗炎療效并能影響心室重構(gòu)，塞來昔布通過抑制COX-2阻止炎性前列腺素類物質(zhì)的產(chǎn)生，達(dá)到抗炎、鎮(zhèn)痛及退熱作用[4，5]。這兩種藥物目前未被納入治療高血壓心肌肥厚臨床用藥指南，且治療機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)將通過腹主動(dòng)脈縮窄法構(gòu)建心肌肥厚大鼠模型來探討COX抑制劑對(duì)壓力超負(fù)荷性心肌肥厚大鼠心室重構(gòu)的潛在治療作用及機(jī)制，為臨床擴(kuò)大藥物治療方案提供依據(jù)。

材料與方法

1.藥品與試劑:阿司匹林腸溶片購(gòu)自辰欣藥業(yè)股份有限公司；塞來昔布膠囊購(gòu)自輝瑞公司進(jìn)口分包裝；大鼠TNF-α、IL-10 ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自泉州市睿信生物科技有限公司；蘇木精-伊紅、Masson 三色染色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京博奧森有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組：雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量200±20g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、模型+阿司匹林組、模型+塞來昔布組。

3.動(dòng)物模型的制備及灌胃處理：正常對(duì)照組不作任何處理，其余3組按照Anderson法[6]制造壓力超負(fù)荷性心肌肥厚大鼠模型，操作步驟如下：稱體質(zhì)量，用2%戊巴比妥鈉溶液1.0ml/400g(50mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉時(shí)長(zhǎng)為1.5h左右，固定，備皮，消毒，分層開腹，先剪開皮膚，在剪開肌肉層盡量避免剪到小血管，用手術(shù)器械夾住皮膚和肌肉以便獲取良好視野，預(yù)先準(zhǔn)備好用鹽水浸泡的棉球，塞入腹腔內(nèi)部，目的是讓腹主動(dòng)脈更凸顯出來便于操作，在右側(cè)腎動(dòng)脈上方游離腹主動(dòng)脈，沿腹主動(dòng)脈長(zhǎng)軸置直徑為0.7mm的針頭，用無菌4號(hào)手術(shù)線結(jié)扎腹主動(dòng)脈及針頭，抽出針頭，此時(shí)腹主動(dòng)脈殘留0.7mm的殘腔。檢查腹腔內(nèi)干凈無遺留物后，肌肉層縫合后噴淋硫酸慶大霉素溶液，皮膚縫合后噴淋硫酸慶大霉素溶液，在大鼠后肢根部用碘伏消毒，肌內(nèi)注射青霉素鈉10萬單位，圍上紗布保溫，肌內(nèi)注射在每天同一時(shí)間連續(xù)注射5天。術(shù)后次日起，正常對(duì)照組和模型組以0.9%氯化鈉溶液安慰劑2ml/(100g·d)灌胃，阿司匹林組以阿司匹林溶液10mg/(100g·d)灌胃，塞來昔布組以塞來昔布溶液 1.8mg/(100g·d)灌胃，4組大鼠按連續(xù)灌胃時(shí)間分為第8、10、12、14周。在構(gòu)建模型及治療中，大鼠因術(shù)中出血、術(shù)后感染及腸梗阻等死亡，死亡率在30%左右，最終造模成功并取材的大鼠為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組8只。

4.實(shí)驗(yàn)方法：(1)左心室質(zhì)量指數(shù)測(cè)定：取出大鼠心臟后，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液清洗心腔，濾紙吸干水分，剔除左心室，稱重后計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)。(2)心肌組織病理學(xué)評(píng)價(jià)：4%多聚甲醛固定左心室組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片4μm。行HE染色，顯微鏡下觀察，計(jì)算心肌細(xì)胞直徑。Masson染色計(jì)算膠原沉積百分比。(3)ELISA 檢測(cè)血漿炎性細(xì)胞因子：腹主動(dòng)脈采集血液離心，取上清液至 EP 管，-80℃保存，ELISA 檢測(cè)血漿炎性細(xì)胞因子 TNF-α、IL-10 的含量。(4)免疫組織化學(xué)檢測(cè)：取出心臟標(biāo)本行免疫組化染色，一抗為大鼠Rabbit anti-Notch1 antibody (北京博奧森有限公司，bs-1335R)、Rabbit anti-HEY2 antibody (北京博奧森有限公司，bs-9461R)，二抗為北京博奧森有限公司的二抗試劑盒。

結(jié) 果

1.左心室質(zhì)量指數(shù):第8、10、12及14周模型組內(nèi)左心室質(zhì)量指數(shù)時(shí)間依從性增大，正常對(duì)照組、塞來昔布組、阿司匹林組組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較：在第8周時(shí)，模型組與正常對(duì)照組比較增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組與塞來昔布組、阿司匹林組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在第10周時(shí)，可能由于個(gè)體差異，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在第12、14周時(shí)，模型組與正常對(duì)照組比較，顯著性增加(P分別為<0.05、<0.01)，第12周時(shí)模型組與塞來昔布組、阿司匹林組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為<0.05、<0.01)；第14周時(shí)的阿司匹林與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而塞來昔布組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，阿司匹林組與塞來昔布組左心室質(zhì)量指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)與正常對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.HE染色:光鏡下觀察，正常對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列致密有序，間隙較小，細(xì)胞大小均勻，胞核大小均一。模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯肥大，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則。阿司匹林組、塞來昔布組較模型組心肌細(xì)胞肥大有所緩解，間質(zhì)細(xì)胞核明顯減少(圖2)。心肌細(xì)胞短軸直徑的測(cè)量結(jié)果,第8、10、12、14周4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的模型組細(xì)胞短直徑增加明顯與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為<0.05、<0.01)，阿司匹林組、塞來昔布組與模型組比較，細(xì)胞短直徑降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為<0.05、<0.01)，阿司匹林組與塞來昔布組比較細(xì)胞短軸直徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，加藥處理后的兩組細(xì)胞短軸直徑時(shí)間依從性減小，阿司匹林組減小更明顯(表1)。

圖2 各組大鼠 HE 染色心肌組織光鏡下病理形態(tài)的改變(×400)

3.Masson染色:各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，正常對(duì)照組的視野內(nèi)淡藍(lán)色區(qū)域較小，膠原纖維在間質(zhì)內(nèi)呈細(xì)絲狀。隨著時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)，模型組心肌纖維化的狀態(tài)越來越嚴(yán)重，視野中淡藍(lán)色區(qū)域面積越來越大，呈片狀。阿司匹林組、塞來昔布組中膠原纖維稍有增生但不及模型組明顯，增生位置主要在血管周圍(圖3)。計(jì)算膠原組織所占百分比，含冠狀動(dòng)脈小血管視野膠原容積百分比(CVF-T)和無冠狀動(dòng)脈小血管視野膠原容積百分比(CVF-NV)。測(cè)量視野中模型組CVF-T、CVF-NV隨著時(shí)間逐漸增大，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為<0.05、<0.01)；阿司匹林組與模型組比較，膠原容積百分比顯著減小(P分別為<0.05、<0.01)，塞來昔布組CVF-T和CVF-NV測(cè)量分別在第10周和第12周開始下降，與模型組比較，膠原容積百分比減小差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為<0.05、<0.01)。塞來昔布組和阿司匹林組第8周CVF-T比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2、表3)。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞短軸直徑的比較

圖3 各組大鼠Masson染色心肌組織光鏡下病理形態(tài)的改變(×400)

4.阿司匹林、塞來昔布對(duì)心肌肥厚大鼠血漿炎性細(xì)胞因子的影響：各個(gè)時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組血漿TNF-α、IL-10濃度基本維持不變；模型組中的TNF-α、IL-10與正常對(duì)照組比較濃度增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為<0.05、<0.01)。阿司匹林組、塞來昔布組的TNF-α、IL-10與模型組比較濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為<0.05、<0.01)。對(duì)于TNF-α，在第8周時(shí)，塞來昔布組顯著高于阿司匹林組(P<0.05)；對(duì)于IL-10，塞來昔布組在第8周、第10周時(shí)顯著高于阿司匹林組(P<0.01)，隨后兩組炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-10含量降至相近(表4、表5)。

表2 各組大鼠膠原纖維CVF-T測(cè)量比較

表3 各組大鼠膠原纖維CVF-NV測(cè)量比較

5.免疫組化染色結(jié)果:(1)Notch1蛋白:Notch1蛋白以棕黃色顆粒的出現(xiàn)為陽(yáng)性表達(dá)。組間Notch1蛋白含量比較，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組與正常對(duì)照組比較表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為<0.05、<0.01)；阿司匹林組在第8、12、14周與模型組比較表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為<0.05、<0.01)，塞來昔布組在14周時(shí)與模型組比較，表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)于加藥處理的兩組，在第8周和第12周時(shí)塞來昔布組蛋白表達(dá)量高于阿司匹林組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為<0.05、<0.01)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，阿司匹林組先上升，在第10周達(dá)頂峰后下降，塞來昔布則上升至第12周后開始下降，在第14周時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4、表6)。(2)Hey2蛋白:Hey2蛋白以棕黃色顆粒的出現(xiàn)為陽(yáng)性表達(dá)。在第8、10、12、14周，模型組與正常對(duì)照組Hey2蛋白量增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；阿司匹林組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。塞來昔布組在第12、14周時(shí)與模型組比較，表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨時(shí)間延長(zhǎng)，阿司匹林在第10周時(shí)蛋白含量達(dá)峰值后開始下降，塞來昔布則在第12周后開始下降，塞來昔布組與阿司匹林組比較，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5、表7)。

表4 各組大鼠血漿中炎性細(xì)胞因子TNF-α的比較

表5 各組大鼠血漿中炎性細(xì)胞因子IL-10的比較

圖4 各組大鼠Notch1蛋白免疫組化染色圖(×400)

表6 各組大鼠心肌細(xì)胞Notch1蛋白平均IOD值表達(dá)情況

圖5 各組大鼠Hey2蛋白免疫組化染色圖(×400)

討 論

心肌肥厚的發(fā)生伴有炎性反應(yīng)，在心室重構(gòu)過程中，炎癥信號(hào)分子增加，各種炎性細(xì)胞在損傷部位浸潤(rùn)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放[7]。炎性細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜，促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子的相對(duì)平衡，有助于控制炎癥，從而維持穩(wěn)態(tài)[8]。TNF-α是常見的促炎性細(xì)胞因子，其濃度上調(diào)與心室重構(gòu)存在明顯的相關(guān)性[9]。IL-10是抗炎性細(xì)胞因子，在下調(diào)炎性反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。本研究中模型組血漿炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-10濃度隨著心肌肥厚的進(jìn)程逐漸增加，說明模型組中促炎性細(xì)胞因子水平的增高將伴隨抗炎性細(xì)胞因子水平的升高，可能促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展。

Notch信號(hào)通路是體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，參與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，主要由Notch受體、Notch配體，通路相關(guān)蛋白及其下游靶蛋白Hes1、Hey2等組成[11]。Notch家族的4個(gè)受體中，Notch1主要在心臟中表達(dá)，對(duì)損傷的心肌發(fā)揮保護(hù)作用[12]。Notch1信號(hào)通路的缺失，會(huì)加劇心肌肥厚[13]。由于Notch1失調(diào)會(huì)導(dǎo)致室間隔異常、瓣膜畸變以及心肌細(xì)胞肥大和細(xì)胞凋亡加劇[14]。在心臟中Notch信號(hào)通路下游基因Hey2在心室表達(dá)，有研究表明如果將Hey2敲除則導(dǎo)致明顯的心臟畸形[15]。本研究中模型組Notch1及Hey2的蛋白表達(dá)水平隨著心肌肥厚的進(jìn)程逐漸增加，Notch信號(hào)通路可能通過負(fù)調(diào)節(jié)心臟基因表達(dá)來限制心肌細(xì)胞肥大的程度，這說明Notch在心臟發(fā)育中具有重要功能，心肌損傷后其激活表明該通路在心臟修復(fù)中發(fā)揮作用，以此達(dá)到保護(hù)心肌受損的目的，這與Croquelois等[13]的研究結(jié)論相同。

表7 各組大鼠心肌細(xì)胞Hey2蛋白平均IOD值表達(dá)情況

阿司匹林、塞來昔布均是COX-2的抑制劑，研究表明，COX-2參與了心室重構(gòu)、心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展，與TNF-α共同促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生[16，17]。炎性反應(yīng)的發(fā)生與Notch1信號(hào)通路也相關(guān)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道TNF-α通過NF-κB炎癥信號(hào)通路與Notch信號(hào)通路發(fā)生串?dāng)_。此外在心室重構(gòu)過程中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，例如巨噬細(xì)胞，在巨噬細(xì)胞分化過程中，Notch1導(dǎo)致大量M1型巨噬細(xì)胞分化，促使炎性細(xì)胞因子釋放，引發(fā)炎性反應(yīng)[18]。阿司匹林、塞來昔布是非甾體類抗炎藥，長(zhǎng)期服用阿司匹林對(duì)心臟有保護(hù)和抗氧化的作用，長(zhǎng)期使用塞來昔布可減輕心肌肥厚和纖維化的形成[19，20]。本研究中，經(jīng)兩藥物處理可降低心肌細(xì)胞肥大、減輕心肌纖維化程度，血漿TNF-α、IL-10濃度下降顯著，表明此兩種藥物可降低心肌肥厚大鼠體內(nèi)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，達(dá)到保護(hù)心肌的療效。加藥處理后，兩組Notch1和Hey2蛋白表達(dá)量隨時(shí)間推移整體先升高后下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明阿司匹林、塞來昔布可降低Notch1信號(hào)通路的活性，這提示環(huán)氧化酶抑制劑可能通過減少Notch1信號(hào)通路激活，進(jìn)而降低體內(nèi)炎性反應(yīng)，從而達(dá)到保護(hù)心肌的作用。

通過塞來昔布組與阿司匹林組比較，早期塞來昔布組TNF-α、IL-10含量顯著高于阿司匹林組，后期塞來昔布和阿司匹林對(duì)降低體內(nèi)炎性細(xì)胞因子的作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在檢測(cè)Notch1和Hey2蛋白時(shí)，阿司匹林組在第10周達(dá)頂峰然后開始下降，而塞來昔布組第12周含量達(dá)頂峰之后開始下降，到第14周時(shí)，兩組間Notch1蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見，阿司匹林及塞來昔布對(duì)壓力超負(fù)荷性心肌肥厚治療有一定顯著效果，但阿司匹林對(duì)于超負(fù)荷心肌肥厚的治療作用更加顯著，而塞來昔布作用的時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)揮作用較阿司匹林遲緩，在長(zhǎng)時(shí)間的藥物治療下，可以達(dá)到相同的治療效果。

綜上所述，環(huán)氧化酶抑制劑對(duì)壓力超負(fù)荷性心肌肥厚大鼠有一定的治療作用，且阿司匹林發(fā)揮作用較快，其機(jī)制可能與降低Notch1信號(hào)通路的活性，緩解炎性反應(yīng)有關(guān)。Notch1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在心臟疾病及炎性反應(yīng)中的潛在影響是廣泛的，這也提示Notch1信號(hào)通路可作為預(yù)防和治療心肌肥厚潛在的新靶點(diǎn)，為臨床的治療提供新的研究方向。