李永光,簡(jiǎn)瑩娜,賀勝,李秀萍,胡勇,王戈平,王光華,林偉山,馬利青

(1.青海省民和縣畜牧獸醫(yī)站,民和 810800；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

近年來(lái)，國(guó)家加大對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展的扶持力度，畜牧養(yǎng)殖業(yè)也取得了更好更快的發(fā)展，其中從事羊養(yǎng)殖的農(nóng)戶逐漸增多，羊養(yǎng)殖的規(guī)模也越來(lái)越大。皮下膿腫成為羊常見(jiàn)的疾病之一，不但影響羊只的生長(zhǎng)、影響羊毛和羊皮質(zhì)量，降低畜產(chǎn)品品質(zhì)，甚至造成死亡，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。羊肉制品中有膿包，直接影響肉質(zhì)品質(zhì)，并且有潛在的食品安全隱患。

羊皮下膿腫病存在于幾乎所有養(yǎng)羊的國(guó)家或地區(qū)，是國(guó)際公認(rèn)的難以防治的傳染病之一。皮下膿腫病是由化膿病菌通過(guò)感染羊受損的皮膚或黏膜所引起的一種羊傳染性疾病。病畜通過(guò)長(zhǎng)期排膿，導(dǎo)致病原隨著排出的膿汁在羊群中進(jìn)行傳播，影響羊只的生長(zhǎng)發(fā)育以及羊產(chǎn)品的質(zhì)量，進(jìn)而對(duì)羊養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病普遍存在于養(yǎng)羊業(yè)中，其主要原因可能與病原種類(lèi)較多有關(guān)，已知偽結(jié)核棒狀桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌等病原菌能導(dǎo)致山羊感染發(fā)病。

肖芳萍等[1]認(rèn)為羊的疥螨病、羊痘、羊口瘡、羊偽結(jié)核病，都發(fā)生于羊的體表皮膚，認(rèn)為以上病原為誘發(fā)皮下膿腫的重要致病原。

陳玉祥、萬(wàn)一元等[2，3]認(rèn)為，干酪樣淋巴結(jié)炎以及皮膚膿腫其主要病原為人畜共患的偽結(jié)核棒狀桿菌感染所引起的一種接觸性、慢性傳染病，特征為局部淋巴結(jié)發(fā)生干酪樣壞死，病羊膿汁污染的飲水、飼料等是重要的傳染媒介，其次有松鼠葡萄球菌及鏈球菌、四聯(lián)球菌等。偽結(jié)核棒狀桿菌可引起多種動(dòng)物感染，主要有羊干酪性淋巴結(jié)炎、駱駝膿腫、馬潰瘍性淋巴結(jié)炎、兔化膿性感染和人的化膿性淋巴管炎。自然發(fā)病中，羊發(fā)病率較高，常在30%以上[4]。感染發(fā)生于破損皮膚，也可通過(guò)攝食污染的飼料引起。動(dòng)物感染無(wú)特征性臨床表現(xiàn)，主要有體溫升高，食欲減退，精神差，生產(chǎn)性能下降，皮下及淋巴結(jié)出現(xiàn)化膿性病變，呈膿性干酪樣壞死，有的病菌侵入體內(nèi)，在肝、脾、肺、子宮角、腸系膜等處發(fā)生大小不等的結(jié)節(jié)，內(nèi)含黃白色的膿性干酪樣物質(zhì)。嚴(yán)重的患病孕畜產(chǎn)出死胎、畸胎，嚴(yán)重者甚至引起病羊死亡[5]。由于該病發(fā)生緩慢，臨床癥狀不明顯，常被人們忽視，但它卻是世界上公認(rèn)的難以治愈的傳染病之一，一旦侵入畜群，很難徹底根除，給養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于羊皮下膿腫病，其致病菌主要為偽結(jié)核棒狀桿菌和金黃色葡萄球菌兩種[6]。

化膿隱秘桿菌，于1893 年首次發(fā)現(xiàn)，原稱(chēng)化膿棒狀桿菌，1997 年 Pascual Ramos等將該菌從放線菌屬中重新分類(lèi)為隱秘桿菌屬，化膿隱秘桿菌在隱秘桿菌屬中致病性最強(qiáng)，是一種條件性致病菌，化膿隱秘桿菌不僅感染牛羊豬等經(jīng)濟(jì)類(lèi)動(dòng)物，同時(shí)也會(huì)感染貓、狗、兔、狐貍、猴、鵝和鴨等其他動(dòng)物[7]。李章程等[8]在山羊皮下膿腫病料采集中分離出化膿隱秘桿菌。

本論文研究目的在于檢測(cè)并分離該合作社羊皮膚膿腫病原，對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定、致病性研究以及耐藥性試驗(yàn)，提出合理的預(yù)防、治療方案，減少該合作社的養(yǎng)殖損失。

1 試驗(yàn)方法

1.1 發(fā)病情況

民和縣某合作社養(yǎng)殖品種為湖羊，為網(wǎng)床全舍飼養(yǎng)殖，主要飼草料為青貯和當(dāng)?shù)禺a(chǎn)牧草，精飼料自配(主要成分為玉米、麩皮和麻渣)，預(yù)混料為外購(gòu)?，F(xiàn)飼養(yǎng) 215 只湖羊，發(fā)病羊只 11 只，在頸部、頭部、或在四肢處有皮下膿腫，其中 4 只病羊患處已開(kāi)始變硬吸收，另外 7 只患病羊患部膿包處質(zhì)地軟，并發(fā)燙。

1.2 樣品采集及病原菌分離

無(wú)菌采集了 7 只羊的皮下膿腫內(nèi)容物，簡(jiǎn)述之：患部剃毛，先用碘酒棉球消毒，再用酒精棉球脫碘，再用 5 mL 注射器 16#針頭刺破膿包，緩緩吸出皮下膿腫內(nèi)容物，至病料采集箱冷藏保存，及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.3 致病性研究

取該分離菌株接種至普通肉湯，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)18 h，取培養(yǎng)物，注射昆明系小鼠，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組2組以及對(duì)照組，每組2只，其中：實(shí)驗(yàn)組 Ⅰ，對(duì)每只實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射分離菌18 h培養(yǎng)物0.5 mL；實(shí)驗(yàn)組 Ⅱ 每只實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射 0.2 mL；對(duì)照組腹腔注射營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，每只0.5 mL。

1.4 分子生物學(xué)診斷

將分離細(xì)菌利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，利用細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并切膠純化將其送至金唯智生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn)

本試驗(yàn)對(duì)分離菌株利用K-B擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 病原分離

將7份無(wú)菌采集的患羊皮下膿腫內(nèi)容物送檢至實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)組織涂片染色，膿腫內(nèi)容物中檢測(cè)到疑似球菌，在組織涂片中的細(xì)菌形態(tài)詳見(jiàn)圖1。同時(shí)，接種至普通肉湯、厭氣肉肝湯和鮮血鞋面培養(yǎng)基上，進(jìn)行可疑菌的分離培養(yǎng)，經(jīng)37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，在鮮血平板培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)出中等大小、具有典型β溶血環(huán)的乳白色菌落，36 h后變?yōu)榻瘘S色菌落，經(jīng)革蘭氏染色，該分離菌株為革蘭氏陽(yáng)性球菌，其形態(tài)與組織片中檢測(cè)細(xì)菌一致，其形態(tài)詳見(jiàn)圖2。

圖1 膿腫內(nèi)容物組織瑞特氏染色

圖 2 分離細(xì)菌革蘭氏染色形態(tài)

2.2 致病性研究

經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組 Ⅰ 于注射后24 h死亡1只，48 h內(nèi)死亡1只；實(shí)驗(yàn)組 Ⅱ 在注射后60 h左右死亡1只；對(duì)照組96 h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)任何異常；并且在致死實(shí)驗(yàn)小鼠的肝臟中分離得到該菌，說(shuō)明該菌株具有一定的致病性。

2.3 分子生物學(xué)試驗(yàn)

經(jīng)PCR鑒定到目的片段，結(jié)果見(jiàn)圖3，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行在線“BLAST”比對(duì)，鑒定該菌株為金黃色葡萄球菌。

圖3 細(xì)菌16S rRNA PCR檢測(cè)結(jié)果圖(M：DL2000；1：分離菌株樣品DNA)

2.4 藥物敏感試驗(yàn)

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示：該菌株對(duì)新生霉素(NV)、阿莫西林(AMC)、頭孢噻吩(KF)、阿米卡星(AK)、頭孢唑林(KZ)、氨芐西林(AMP)、克林霉素(DA)、頭孢吡虧(FEP)、氧氟沙星(OFX)、阿奇霉素(AZM)、慶大霉素(CN)等敏感，而對(duì)環(huán)丙沙星(CIP)、多粘菌素(PB)耐藥，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 分離菌株(金黃色葡萄球菌)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

經(jīng)染色鏡檢、病原菌的分離培養(yǎng)、PCR檢測(cè)、致病性試驗(yàn)以及藥物敏感研究，從患病羊只膿汁處分離培養(yǎng)到致病性金黃色葡萄球菌，該菌對(duì)于檢測(cè)的大多數(shù)藥物均敏感，而對(duì)環(huán)丙沙星(CIP)及多粘菌素(PB)耐藥。

4 討論

對(duì)該合作社進(jìn)行樣品采集并調(diào)研時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)其網(wǎng)床多處有尖銳的鐵絲、鋼管接頭、劈開(kāi)的漏糞地板竹板等，所以該養(yǎng)殖場(chǎng)羊只患皮膚膿腫疾病與養(yǎng)殖環(huán)境造成羊只創(chuàng)傷有直接關(guān)系。一般病原菌存在于環(huán)境中，可通過(guò)損傷的皮膚、污染的剪毛工具、斷尾器械或藥浴傳播，并發(fā)生皮膚感染。如不恰當(dāng)?shù)乃幵?、剪毛，羊圈中的釘子、鐵絲尖頭沒(méi)有清理均易造成病菌的傳播。病理性損傷引起患羊的皮膚增厚、膿腫、有干酪樣滲出物，膿汁流出與毛纖維混合，在被毛形成氈硬痂。部分患病羊感染病原菌后可取道于淋巴源性和血源性擴(kuò)散，引起各內(nèi)臟器官的轉(zhuǎn)移性膿腫，常見(jiàn)于關(guān)節(jié)腔和臟器膿腫。

從本研究分離培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看，只分離得到了金黃色葡萄球菌，該菌對(duì)于檢測(cè)的大多數(shù)藥物均敏感，而對(duì)環(huán)丙沙星及多粘菌素耐藥，也能反映出該養(yǎng)殖合作社抗生素使用相對(duì)規(guī)范，該菌株沒(méi)有出現(xiàn)高度耐藥情況。

但經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道，學(xué)者們還分離得到多種病原，葡萄球菌、偽結(jié)核棒狀桿菌、化膿性隱秘桿菌、壞死梭桿菌、羊傳染性膿皰病毒及羊痘病毒等[3,8-11]。因此，多種病原菌及病毒的存在，給防治該病帶來(lái)一定的麻煩和不可預(yù)見(jiàn)性。對(duì)于養(yǎng)殖中出現(xiàn)皮膚膿腫疾病，建議對(duì)其致病細(xì)菌或病毒進(jìn)行及時(shí)地檢測(cè)，利用敏感抗生素治療或者疫苗進(jìn)行免疫，切不可亂用抗生素以避免抗生素殘留以及耐藥菌株的產(chǎn)生。