劉 玲，李 璟，范 蕾，宣 焱，杜 淼，張德玖，李卓禧，陳曉聰，楊婭男，徐本錦

2019年12月，由新冠病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎疫情在中國(guó)武漢暴發(fā)，患者表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、肺部磨玻璃樣病變等呼吸系統(tǒng)病變，或伴隨腹瀉等消化系統(tǒng)癥狀[1-2]。截止2021年9月28日，新冠肺炎累計(jì)確診病例已超過2.31億例，累計(jì)死亡病例超過475萬例[3]。新冠疫情的迅速蔓延給全球醫(yī)療體系帶來了嚴(yán)峻考驗(yàn)。因此，揭示SARS-CoV-2的傳播機(jī)制及其關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)與功能成為遏制疫情的關(guān)鍵。

SARS-CoV-2屬β冠狀病毒，是一種包膜單股正鏈RNA病毒[4-5]。其基因組約30 kb，由一個(gè)5′帽子和5′非翻譯區(qū)(5′UTR)，10個(gè)開放讀碼框(open reading frames，ORFs)以及一個(gè)多聚腺苷酸化的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)組成[6]。ORF1a和ORF1b是SARS-CoV-2的2個(gè)主要ORF，約占病毒基因組的70%(圖1)。ORF1ab通過核糖體移碼被翻譯成多聚蛋白pp1a或pp1ab[7-8]，最后被加工成16種非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein，NSPs)，NSPs具有多種酶活性，參與病毒RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

Nsp1由ORF1a的5′ 末端編碼(圖1)，是感染細(xì)胞中產(chǎn)生的第1種冠狀病毒蛋白[9]，其主要功能是通過結(jié)合核糖體抑制宿主基因表達(dá)[10-11]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)SARS-CoV-2 Nsp1蛋白結(jié)構(gòu)與功能方面的研究報(bào)道仍然較少。本研究利用生信分析手段對(duì)SARS-CoV-2 Nsp1的性質(zhì)、翻譯后修飾、結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行了系統(tǒng)分析，還對(duì)其進(jìn)行了同源性分析、進(jìn)化分析及原核表達(dá)。本研究有助于揭示Nsp1在SARS-CoV-2侵染宿主細(xì)胞中的作用機(jī)制，同時(shí)有助于加快針對(duì)Nsp1的靶向藥物研發(fā)。

圖1 SARS-CoV-2基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic of SARS-CoV-2 genome organisation

1 材料與方法

1.1 材料 限制性核酸內(nèi)切酶NdeI、XhoI購(gòu)自NEB，pET-22b空質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自寶生物(大連)，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒提取、凝膠回收試劑盒以及感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金公司，其它生化試劑購(gòu)自國(guó)藥。

1.2 載體構(gòu)建及原核表達(dá) 用XhoI和NdeI對(duì)pET-22b空質(zhì)粒和Nsp1基因同時(shí)雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后將Nsp1基因與載體連接，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。Nsp1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)步驟參照文獻(xiàn)執(zhí)行[12]。

1.3 生信分析 對(duì)Nsp1蛋白的理化特性、跨膜螺旋、親/疏水性等進(jìn)行全面分析，相關(guān)分析網(wǎng)站如表1所示。Nsp1蛋白的多序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析參照文獻(xiàn)執(zhí)行[12]。

表1 生物信息分析網(wǎng)址Tab.1 Bioinformatics analysis websites

2 結(jié) 果

2.1 Nsp1的理化特性 Nsp1由180個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成(共20種)，相對(duì)分子量19.78 kDa，等電點(diǎn)5.36，負(fù)電性氨基酸殘基數(shù)(Asp + Glu)為27，正電性氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為19，占比最高的殘基是甘氨酸(12.20%)，其次是纈氨酸和亮氨酸(均為11.70%)。見表2。Nsp1的分子式為C872H1383N247O270S4，原子總數(shù)為2 776，消光系數(shù)12 950(mol/L)-1cm-1。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的半衰期約30 h，在酵母中超過20 h，在E.coli內(nèi)超過10 h。Nsp1的不穩(wěn)定指數(shù)約28.83，脂肪系數(shù)達(dá)89.72，平均親水性指數(shù)-0.378。

表2 新冠病毒Nsp1蛋白的氨基酸組成Tab.2 Amino acid composition of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.2 Nsp1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析 在線預(yù)測(cè)Nsp1的跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白無跨膜區(qū)(圖2)。

圖2 新冠病毒Nsp1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Transmembrane structure prediction of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.3 Nsp1的親水與疏水特性 結(jié)果表明，Nsp1的L88疏水特性最強(qiáng)，分值1.878，N162親水特性最強(qiáng)，分值-2.611；含有親水氨基酸112個(gè)，疏水氨基酸60個(gè)，平均親水指數(shù)-0.378，提示Nsp1是一個(gè)親水蛋白(圖3)。

圖3 新冠病毒Nsp1蛋白親水/疏水性分析Fig.3 Hydrophobic/hydrophobic analysis of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.4 Nsp1的磷酸化修飾預(yù)測(cè) Nsp1存在12個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)，其中S17、S34、S40、S74、S100、S135、S142和S166為絲氨酸修飾位點(diǎn)，T151為蘇氨酸修飾位點(diǎn)，Y68、Y97和Y154為酪氨酸修飾位點(diǎn)(圖4、表3)。

圖4 新冠病毒Nsp1蛋白的磷酸化位點(diǎn)Fig.4 Phosphorylation sites of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

表3 Nsp1蛋白的磷酸化位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的激酶Tab.3 Phosphorylation sites of Nsp1 protein and corresponding kinases

2.5 Nsp1蛋白亞細(xì)胞定位與信號(hào)肽預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)得知56.5%的Nsp1在細(xì)胞質(zhì)，30.4%存在于細(xì)胞核，線粒體、分泌小泡和細(xì)胞骨架中各占4.3%。對(duì)N端前70個(gè)殘基進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，Nsp1蛋白不含信號(hào)肽(圖5)。

圖5 新冠病毒Nsp1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of SARS-CoV-2 Nsp1 protein signal peptide

2.6 Nsp1蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 沒有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)不太可能暴露于N-糖基化機(jī)制，因此可能不會(huì)被糖基化(在體內(nèi))。利用NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，Nsp1蛋白可能不會(huì)被N-糖基化修飾(圖6)。

圖6 新冠病毒Nsp1蛋白N-糖基化位點(diǎn)Fig.6 N-glycosylation site of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

O-糖基化修飾預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Nsp1有3個(gè)可能的O-糖基化修飾位點(diǎn)：S40、S74和T163(圖7)。

圖7 新冠病毒Nsp1蛋白O-糖基化位點(diǎn)Fig.7 O-glycosylation sites of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.7 Nsp1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 使用Prabi網(wǎng)站對(duì)Nsp1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，Nsp1中α-螺旋占25.56%，延伸鏈占20.56%，β-轉(zhuǎn)角占8.89%，無規(guī)則卷曲占45.00%(圖8)。

圖8 新冠病毒Nsp1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.8 Secondary structure of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.8 Nsp1蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò) 最新的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示[13]，Nsp1與6個(gè)蛋白存在相互作用，分別是：DNA引物酶小亞基(PRIM1)，DNA引物酶大亞基(PRIM2)，DNA聚合酶α復(fù)合物催化亞基(POLA1)，DNA聚合酶α復(fù)合物輔助亞基(POLA2)，Plakophilin-2(PKP2)及前膠原半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1(COLGALT1)(圖9)。

圖9 新冠病毒Nsp1蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.9 Interaction network of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.9 Nsp1蛋白結(jié)構(gòu)域分析 Nsp1含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，N端為冠狀病毒Nsp1球狀結(jié)構(gòu)域(T12-G133)，C端為β-冠狀病毒Nsp1 C末端結(jié)構(gòu)域(E148-G179)(圖10)。Nsp1是α冠狀病毒和β冠狀病毒的一個(gè)特征性蛋白，在抑制宿主基因表達(dá)和抗病毒反應(yīng)方面表現(xiàn)出功能保守性和機(jī)制多樣性。盡管冠狀病毒Nsp1蛋白之間的序列同源性較低，但其核心結(jié)構(gòu)共享一個(gè)相對(duì)保守的球狀結(jié)構(gòu)域。

圖10 新冠病毒Nsp1蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Fig.10 Domain analysis of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

Sarbe冠狀病毒Nsp1的C末端結(jié)構(gòu)域通過與核糖體40S亞基的mRNA通道結(jié)合，干擾mRNA結(jié)合進(jìn)而抑制宿主蛋白質(zhì)翻譯。這種抑制機(jī)制可能是Sarbe冠狀病毒特有的，因?yàn)镹sp1的C端在α冠狀病毒中較短，并且在包括MERS冠狀病毒在內(nèi)的其他β冠狀病毒中并不高度保守。

2.10 Nsp1蛋白的三維結(jié)構(gòu) 根據(jù)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)建立網(wǎng)站構(gòu)建Nsp1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果只顯示10～126位點(diǎn)，148～180位點(diǎn)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(圖11)。

圖11 新冠病毒Nsp1蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析Fig.11 Three-dimensional structure analysis of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.11 Nsp1蛋白序列同源性分析 通過Uniprot網(wǎng)站檢索發(fā)現(xiàn)，與新冠Nsp1序列最接近的是Bat SARS-like coronavirus WIV1(85.0%)，接著是Bat coronavirus Rp/Shaanxi 2011、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒、SARS coronavirus WH20和SARS coronavirus PUMC02，序列一致性均為84.4%，與Bat Hp-betacoronavirus/Zhejiang2013的序列相似度為28.7%。所有序列中相同的殘基占比21.1%(*所示)，性質(zhì)相似的占比19.4%(:所示)，相似性較低的占比16.1%(.所示)(圖12)。

圖12 新冠病毒Nsp1蛋白序列同源性Fig.12 Homology of SARS-CoV-2 Nsp1 protein sequence

2.12 Nsp1的進(jìn)化樹構(gòu)建 結(jié)果顯示，這15種病毒的蛋白與SARS-CoV-2的Nsp1蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，BtRs-BetaCoV/YN2013與非典型冠狀病毒HKU3聚為一支，置信度為72，聚為一支后與蝙蝠非典型冠狀病毒W(wǎng)IV1聚為一支，置信度為39。此外，BtRf-BetaCoV/JL2012與Bat SARS-like coronavirus YNLF_31C聚類為同一支，置信度78；Bat coronavirus Rp/Shaanxi2011與BtRs-BetaCoV/HuB2013聚類為同一支，置信度48(圖13)。

圖13 新冠病毒Nsp1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.13 Phylogenetic tree of SARS-CoV-2 Nsp1 protein

2.13 表達(dá)載體pET-22b-Nsp1的構(gòu)建

2.13.1Nsp1的酶切與PCR驗(yàn)證 用NdeI與XhoI對(duì)Nsp1進(jìn)行酶切(圖14A)；PCR擴(kuò)增Nsp1序列，電泳檢測(cè)顯示片段大小合適(圖14B)。

A：Nsp1雙酶切實(shí)驗(yàn) 1：Nsp1酶切產(chǎn)物 M：2-log DNA marker B：菌落PCR 1～6陽性單克隆 圖14 Nsp1的酶切與菌落PCRFig.14 Restriction endonuclease digestion and colony PCR validation of Nsp1

2.13.2 pET-22b-Nsp1的酶切及轉(zhuǎn)化 用NdeI與XhoI同時(shí)酶切重組載體，電泳檢測(cè)顯示片段大小正確(圖15A)；將pET-22b-Nsp1轉(zhuǎn)化Top10，于37 ℃恒溫培養(yǎng)13 h(圖15B左)，提取質(zhì)粒后測(cè)序驗(yàn)證，選取正確的轉(zhuǎn)化BL21(圖15B右)。

A：pET-22b-Nsp1酶切實(shí)驗(yàn) 1：不酶切 2：雙酶切 B：pET-22b-Nsp1轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(左：Top10，右：BL21)圖15 pET-22b-Nsp1的酶切和轉(zhuǎn)化Fig.15 Enzyme digestion and transformation of pET-22b-Nsp1

2.14 Nsp1的蛋白表達(dá) 菌體培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí)用0.5 mmol/L IPTG去誘導(dǎo)，12%SDS-PAGE檢測(cè)顯示，Nsp1蛋白表達(dá)量經(jīng)誘導(dǎo)之后顯著上調(diào)(泳道4和泳道10)；對(duì)誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的全細(xì)胞裂解液、上清液、沉淀分別檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，Nsp1主要表達(dá)在沉淀(泳道3、6；泳道9、12)(圖16)。對(duì)泳道6和12的相應(yīng)位置進(jìn)行切膠并質(zhì)譜鑒定(圖17)，發(fā)現(xiàn)沉淀中表達(dá)的確實(shí)是目標(biāo)蛋白Nsp1。

圖16 Nsp1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)Fig.16 Detection of induced expression of Nsp1 protein

圖17 Nsp1蛋白的質(zhì)譜鑒定Fig.17 Identification of nsp1 protein by mass spectrometry

3 討 論

新冠疫情的全球蔓延給世界公共衛(wèi)生安全帶來了巨大挑戰(zhàn)，盡快闡明SARS-CoV-2的傳播機(jī)制并開發(fā)有效的抗病毒藥物是遏制疫情蔓延的關(guān)鍵所在[14]。結(jié)構(gòu)分析顯示，Nsp1的C末端結(jié)構(gòu)域阻礙mRNA在核糖體上的進(jìn)入通道(mRNA entry tunnel)，加速宿主細(xì)胞mRNA降解，導(dǎo)致宿主蛋白合成減少并促進(jìn)病毒存活[11,15]。Nsp1還能有效阻斷RIG-I依賴的先天免疫反應(yīng)，抑制宿主細(xì)胞對(duì)病毒的清除[11,16]。由于Nsp1參與病毒生命周期的多個(gè)階段，因此它是一個(gè)潛在的抗病毒靶點(diǎn)和重要的毒力因子。

生物信息學(xué)分析對(duì)于目的蛋白的表達(dá)具有很強(qiáng)的指導(dǎo)意義，E.coli表達(dá)系統(tǒng)以其安全性好、操作簡(jiǎn)便、表達(dá)量高、容易放大培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于基因工程藥物生產(chǎn)[17]。此外，原核表達(dá)對(duì)于快速制備抗體和體外功能研究具有較大優(yōu)勢(shì)。目的蛋白的理化性質(zhì)、分子量、氨基酸組成、等電點(diǎn)、親疏水性、序列保守程度、GC含量、密碼子組成等對(duì)于原核表達(dá)都具有重要影響。通常情況下，蛋白分子量超過100 kD或低于5 kD時(shí)均難以表達(dá)。分子量太小的易被降解，通過加入融合標(biāo)簽GST、Trx、MBP或者較大的促融合蛋白標(biāo)簽有助于使目的蛋白正確折疊，并以可溶形式表達(dá)；對(duì)于密碼子進(jìn)行優(yōu)化，也可提高目的蛋白的翻譯效率和表達(dá)量。本文生物信息學(xué)分析顯示，Nsp1蛋白分子量19.78 kDa，等電點(diǎn)5.36，性質(zhì)較穩(wěn)定，在哺乳動(dòng)物中半衰期約30 h，在E.coli內(nèi)大于10 h，無信號(hào)肽和跨膜螺旋，親水性較強(qiáng)，不屬于分泌蛋白。無規(guī)則卷曲在Nsp1蛋白中占比最高(45.00%)，其次是α螺旋(25.56%)和延伸鏈(20.56%)，以上結(jié)果為進(jìn)一步揭示該蛋白的結(jié)構(gòu)及功能提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

糖基化和磷酸化修飾是生物體內(nèi)最重要的翻譯后修飾方式，糖基化對(duì)蛋白的折疊、免疫原性、穩(wěn)定性及定位具有重要影響。磷酸化修飾可改變蛋白的生物活性，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。蛋白的磷酸化修飾與病毒粒子增殖、組裝和復(fù)制密切相關(guān)，在調(diào)控病毒與宿主的代謝中起重要作用。本研究分析顯示，Nsp1有3個(gè)O-糖基化位點(diǎn)及12個(gè)磷酸化位點(diǎn)，然而仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。系統(tǒng)鑒定病毒蛋白的磷酸化位點(diǎn)并揭示其調(diào)控機(jī)制將有助于抗病毒藥物的研發(fā)和病毒感染機(jī)制的闡明。

SARS-CoV的Nsp1蛋白通過“雙管齊下”的策略抑制宿主基因表達(dá)，它首先結(jié)合核糖體40S亞基，在翻譯起始的不同階段使經(jīng)典的mRNA翻譯(canonical mRNA translation)停滯[18-19]。其次，Nsp1與核糖體結(jié)合導(dǎo)致宿主mRNA的酶切和降解。然而，Nsp1與病毒mRNA的5′ UTR保守區(qū)相互作用進(jìn)而避免自身蛋白翻譯停滯的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[20]。本文多序列比對(duì)顯示，SARS-CoV-2與SARS-CoV的Nsp1序列一致性為84.4%(圖12)，提示二者具有相似的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV Nsp1的C末端殘基K164和H165在β冠狀病毒中高度保守，二者對(duì)Nsp1與40S亞基的相互作用至關(guān)重要，K164A和H165A的突變導(dǎo)致Nsp1無法結(jié)合40S并抑制翻譯起始[19]。近期，Schubert等[21]和Thoms等[11]的電鏡結(jié)構(gòu)分析顯示，SARS-CoV-2 Nsp1的C末端區(qū)域折疊成兩個(gè)螺旋，插入mRNA入口通道，阻礙mRNA進(jìn)入進(jìn)而抑制宿主蛋白翻譯。第1個(gè)螺旋(P153-N160)與40S核糖體蛋白u(yù)S3和uS5形成疏水作用，第2個(gè)螺旋(S166-N178)與eS30和18S rRNA的h18相互作用。保守的KH二肽(K164和H165)與h18形成關(guān)鍵相互作用，這種相互作用是基于H165與U607和U630之間的堿基堆積力，以及K164與G625和U630的磷酸骨架之間的靜電相互作用。此外，SARS-CoV-2 Nsp1的K164和H165殘基對(duì)于核糖體結(jié)合和抑制宿主基因表達(dá)至關(guān)重要[11, 22]。以上結(jié)論與本文多序列比對(duì)結(jié)果相吻合。

結(jié)構(gòu)域分析顯示，Nsp1的N端(T12-G133)為冠狀病毒Nsp1球狀結(jié)構(gòu)域，C端(E148-G179)為β-冠狀病毒Nsp1 C末端結(jié)構(gòu)域(圖10)。Zhao K等[23]對(duì)SARS-CoV-2 Nsp1 N末端(K11-K125)的結(jié)構(gòu)與功能研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的N末端不能與核糖體共定位并抑制宿主蛋白翻譯，單獨(dú)的C端可與核糖體共定位但其抑制蛋白質(zhì)翻譯能力明顯減弱。有趣的是，將Nsp1的C端與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)或其他蛋白融合以取代其N端，可將蛋白翻譯抑制能力恢復(fù)到與全長(zhǎng)Nsp1相當(dāng)水平。這就說明Nsp1的N末端能夠穩(wěn)定C末端同核糖體的結(jié)合，并作為非特異性屏障阻斷mRNA通道從而抑制宿主細(xì)胞翻譯，因此SARS-CoV-2 Nsp1主要通過其C端抑制宿主翻譯，但N末端是Nsp1發(fā)揮功能所必需的。K141、S142和F143殘基靠近SARS-CoV-2 Nsp1的C末端，參與40S核糖體亞基的結(jié)合[11, 21, 24]。本研究發(fā)現(xiàn)，K141-F143序列保守性不高，除SARS-CoV-2之外，其它序列中有14條對(duì)應(yīng)殘基均為K141-Y143。此外，Benedetti等[25]鑒定到一個(gè)K141-F143缺失的SARS-CoV-2基因組，這種缺失變異可能改變Nsp1蛋白的結(jié)構(gòu)，抑制Nsp1同40S核糖體結(jié)合，影響病毒和宿主基因表達(dá)調(diào)控的活性[26]。以上結(jié)果表明，SARS-CoV-2的Nsp1基因正在經(jīng)歷一個(gè)進(jìn)化過程，這可能有助于病毒更好地適應(yīng)人類宿主。

最后，本文構(gòu)建了SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的表達(dá)載體pET-22b-Nsp1并完成原核表達(dá)，初步建立了Nsp1蛋白表達(dá)條件。當(dāng)培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí)加入IPTG(0.5 mmol/L)誘導(dǎo)，先37 ℃、220 r/min培養(yǎng)2.5 h，接著25 ℃、160 r/min繼續(xù)培養(yǎng)9 h。結(jié)果顯示，Nsp1蛋白出現(xiàn)過表達(dá)且主要在細(xì)菌裂解液離心之后的沉淀中表達(dá)(圖16)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定(圖17)，沉淀中主要表達(dá)的確實(shí)是目標(biāo)蛋白Nsp1。因此大規(guī)模純化Nsp1用于疫苗研發(fā)或結(jié)構(gòu)分析應(yīng)考慮優(yōu)先從沉淀中進(jìn)行。另一方面，從功能研究的角度考慮，可采取改變培養(yǎng)溫度16 ℃～30 ℃、降低IPTG濃度(0.01～0.1)mmol/L并延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間使蛋白更多的在上清表達(dá)，因?yàn)樯锨灞磉_(dá)的蛋白要比經(jīng)包涵體純化的蛋白活性好。需要指出的是，本文還預(yù)測(cè)到Nsp1存在糖基化和磷酸化修飾，鑒于原核表達(dá)系統(tǒng)沒有翻譯后修飾功能，因此功能研究實(shí)驗(yàn)應(yīng)考慮從真核系統(tǒng)去表達(dá)該蛋白。

綜上，本文對(duì)SARS-CoV-2的Nsp1進(jìn)行了較為全面的生信分析、表達(dá)載體構(gòu)建及原核表達(dá)，研究結(jié)果將有助于深入了解Nsp1的生物學(xué)功能和設(shè)計(jì)靶向藥?；诒狙芯拷Y(jié)果，將來可針對(duì)以下方向進(jìn)行重點(diǎn)攻關(guān)：1)Nsp1蛋白有效抑制宿主細(xì)胞翻譯但不影響自身蛋白表達(dá)的分子機(jī)制的闡明；2)針對(duì)Nsp1蛋白的靶向藥物設(shè)計(jì)；3)針對(duì)Nsp1蛋白所涉及的關(guān)鍵信號(hào)通路開發(fā)特異性的抑制劑；4)針對(duì)Nsp1蛋白或基因的高靈敏度病毒檢測(cè)方法的開發(fā)；5)系統(tǒng)鑒定Nsp1蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn)并闡明其調(diào)控機(jī)理。

4 結(jié) 論

Nsp1性質(zhì)穩(wěn)定，親水性較強(qiáng)，有多個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)，原核表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其主要在細(xì)菌裂解液離心后的沉淀中表達(dá)。因此，其功能研究可能采用真核系統(tǒng)的可溶性表達(dá)更適宜。此外，該蛋白序列保守性高，且主要定位于宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，提示其功能重要。本研究為針對(duì)該蛋白的純化、結(jié)晶、結(jié)構(gòu)分析、抗體制備和體外功能研究提供了重要的較好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，有助于加快針對(duì)Nsp1的靶向藥物研發(fā)。

(感謝中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所質(zhì)譜平臺(tái)為本文Nsp1蛋白鑒定所提供的大力支持。)

利益沖突：無

引用本文格式：劉玲，李璟，范蕾，等. 新冠病毒Nsp1蛋白結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：566-576. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.074