顏廷喜 郭楓方 劉 露 程可昕 陳明林

（安徽師范大學(xué)安徽省重要生物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安徽蕪湖 241000）

《普通高中生物課程標(biāo)準(zhǔn)（實(shí)驗(yàn)稿）》在教學(xué)建議中提出“注重生物科學(xué)史的學(xué)習(xí)”，《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版2020年修訂）》（以下簡稱《新課標(biāo)》）中再次提到“注重生物科學(xué)史和生物本質(zhì)的學(xué)習(xí)”。高中生物學(xué)課程不僅要求學(xué)生掌握基礎(chǔ)的生物學(xué)知識和基本的生物學(xué)能力，還要讓學(xué)生領(lǐng)悟科學(xué)家在研究過程中的思路和方法。學(xué)習(xí)生物學(xué)科學(xué)史能讓學(xué)生沿著科學(xué)家前進(jìn)的腳步，理解科學(xué)的本質(zhì)和科學(xué)研究的思路和方法，促進(jìn)生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的形成。因此，教師要充分挖掘生物學(xué)科學(xué)史，對科學(xué)史資料進(jìn)行恰當(dāng)?shù)倪x擇和組織，這對中學(xué)生物學(xué)教學(xué)具有重要意義。

1 生物科學(xué)史的選擇要基于科學(xué)事實(shí)

科學(xué)事實(shí)是通過觀察和實(shí)驗(yàn)所獲得的經(jīng)驗(yàn)事實(shí)，是經(jīng)過科學(xué)整理和鑒定的確定事件。一個(gè)科學(xué)事實(shí)往往是先通過觀察，然后通過推斷，接著經(jīng)過一系列的驗(yàn)證和應(yīng)用才被人所承認(rèn)?？茖W(xué)事實(shí)具有重復(fù)性、精確性、可靠性等特征?？茖W(xué)事實(shí)是科學(xué)認(rèn)識形成的基礎(chǔ)，學(xué)生要形成對生物學(xué)的正確認(rèn)識，就要掌握正確的科學(xué)事實(shí)。

《新課標(biāo)》頒布后，高中生物學(xué)教材也進(jìn)行了一輪革新，教材內(nèi)容進(jìn)行了一些調(diào)整，增添了生物科技進(jìn)展、生物科學(xué)史話、科技探索之路、科學(xué)家的故事等欄目，介紹了生物學(xué)的最新進(jìn)展以及生物科學(xué)的發(fā)展歷程。

《新課標(biāo)》對生物技術(shù)與工程模塊提出幾個(gè)大概念，其中包括“基因工程賦予生物新的遺傳特性”，并提出開展以下教學(xué)活動(dòng)：①DNA的提取和鑒定；②利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)驗(yàn)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分和反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。目前，我國不同版本高中生物學(xué)教材對PCR發(fā)明時(shí)間表述不一（表1）。下面通過比較中美現(xiàn)有的幾種高中生物學(xué)教材，結(jié)合國內(nèi)外對PCR反應(yīng)的相關(guān)文獻(xiàn)資料、采訪、自傳等，探索PCR發(fā)明歷程，確定其發(fā)明時(shí)間。

表1 不同生物學(xué)教材中對PCR發(fā)明時(shí)間的描述

目前，生物學(xué)教材中對PCR發(fā)明時(shí)間的描述主要是1983年和1985年。那么，PCR技術(shù)到底是哪一年發(fā)明的呢？

2 PCR科學(xué)史

為準(zhǔn)確把握PCR發(fā)明的時(shí)間歷程，依據(jù)穆里斯發(fā)表的《聚合酶鏈反應(yīng)的不尋常起源》《心靈裸舞》和保羅·拉比諾發(fā)表的《PCR傳奇：一個(gè)生物技術(shù)的故事》等有關(guān)資料，對PCR的發(fā)明歷程進(jìn)行梳理。

2.1 PCR的發(fā)明過程

穆里斯的自傳《心靈裸舞》中描述到，1983年4月的一個(gè)周五晚上，穆里斯在128公路開車的過程中構(gòu)思出PCR的概念。接著，穆里斯在Cetus圖書館進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)檢索，又詢問公司內(nèi)外的科學(xué)家和技術(shù)人員，但沒人聽說過這種技術(shù)。1983年8月，穆里斯首次在Cetus公司會議上提出PCR的概念。那時(shí)，僅有幾個(gè)人感興趣。

1983年9月到12月，穆里斯開始一系列的實(shí)驗(yàn)。1983年9月8日，穆里斯進(jìn)行第一次PCR實(shí)驗(yàn)，以人類生長因子基因作為擴(kuò)增目標(biāo)，分離出一段長約400 bp的片段，采用11 bp和13 bp長的寡核苷酸引物以及聚合酶商用緩沖液，將它們放在一個(gè)試管里進(jìn)行加熱、冷卻、再加熱，第一次實(shí)驗(yàn)并沒有成功。在10月份進(jìn)行的第二次PCR實(shí)驗(yàn)中，穆里斯利用相同的試劑和程序，進(jìn)行加熱溶液、冷卻和添加酶的5或10個(gè)循環(huán)，第二次實(shí)驗(yàn)還是沒有成功。

接下來，穆里斯繼續(xù)深入地探索。穆里斯和助手法魯納選擇一個(gè)較小的目標(biāo)，采用細(xì)菌質(zhì)粒并嘗試更小反應(yīng)體積和更集中的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在凝膠中確實(shí)有東西被擴(kuò)增，但不能明確說明擴(kuò)增了多少。穆里斯認(rèn)為他和法魯納建立了成功的PCR反應(yīng)。

雖然穆里斯已經(jīng)積累一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但仍沒有明確的證據(jù)證明PCR實(shí)驗(yàn)取得成功。

直到1984年10月底，日裔研究員才木全職從事PCR工作。1984年11月15日，才木等人的實(shí)驗(yàn)證明有適當(dāng)大小的產(chǎn)物被擴(kuò)增，但結(jié)果仍然不能令人信服。他們需要更明確的數(shù)據(jù)來證明特異性。

1984年冬～1985年春，才木等人進(jìn)行擴(kuò)增β-珠蛋白的實(shí)驗(yàn)，團(tuán)隊(duì)成員用可靠和可量化的數(shù)據(jù)證明，他們可以將目的基因組DNA擴(kuò)增數(shù)十萬倍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過放射性定量特定序列的數(shù)量和使用寡聚體限制分析來確定。

1985年，Cetus公司計(jì)劃在10月下旬召開的美國人類遺傳學(xué)會議上介紹PCR在人類遺傳病中的應(yīng)用。Cetus公司要求穆里斯根據(jù)pBR322質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)撰寫一篇關(guān)于PCR理論概念的文章；另一篇關(guān)于β-珠蛋白PCR擴(kuò)增的應(yīng)用性文章在理論性論文后提交。但穆里斯堅(jiān)決反對公司計(jì)劃，他主張將PCR作為一個(gè)商業(yè)秘密，不發(fā)表任何文章。

1985年9月20日，才木等人如期提交了PCR應(yīng)用性的文章《酶促擴(kuò)增β-珠蛋白基因組序列和限制性位點(diǎn)分析用于診斷鐮狀細(xì)胞性貧血》（Enzymatic amplifi?cation of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia），1985年12月發(fā)表在上。

1985年12月，穆里斯向雜志提交PCR理論性文章《通過聚合酶催化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在體外特異性合成 DNA》（Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction），但這篇論文被拒了；穆里斯重新向提交這篇文章，文章也被拒。公司建議穆里斯將兩次被拒絕的文章提交給。當(dāng)這篇文章1987年發(fā)表在時(shí)，PCR的信息已廣為人知。

將PCR引入機(jī)器的最后環(huán)節(jié)是需要一種更有效、更特異的聚合酶。穆里斯在1986年第一個(gè)提出使用耐熱的聚合酶，Cetus公司在1988年將提純的熱穩(wěn)定DNA聚合酶運(yùn)用到實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)效果比之前更好。于是，1988年才木等人在上發(fā)表了《引物導(dǎo)向的酶促擴(kuò)增DNA與熱穩(wěn)定DNA聚合酶》（Primer-direct?ed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase）的文章，使得PCR技術(shù)獲得真正的實(shí)踐意義。

直到1987年6月，PCR專利才出現(xiàn)。

2.2 PCR技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)及其說明（1985—1988年）

1985年，才木等人在上發(fā)表了的論文是第一篇正式發(fā)表的PCR文章，采用新方法建立鐮狀細(xì)胞性貧血的快速、高靈敏度產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)，反復(fù)的變性、引物退火和延伸循環(huán)導(dǎo)致引物連接的110堿基對區(qū)域成指數(shù)積累。種新方法就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

1986年，穆里斯在冷泉港定量生物學(xué)研討會上進(jìn)行《DNA體外特異性酶促擴(kuò)增：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)》（Spe?cific enzymatic amplification of DNA in vitro：the poly?merase chain reaction）的報(bào)告。

1986年，沙爾夫等人在上發(fā)表了《酶促擴(kuò)增基因組序列的直接克隆和序列分析》（Direct clon?ing and sequence analysis of enzymatically amplified ge?nomic sequences）。

1986年，才木等人在上發(fā)表了《用等位基因特異性寡核苷酸探針分析酶促擴(kuò)增的β珠蛋白和HLA-DQα DNA》（Analysis of enzymatically amplified β-globin and HLA-DQα DNA with allele-specific oli?gonucleotide probes）。

1987年，穆里斯和法魯納的《通過聚合酶催化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在體外特異性合成DNA》在上發(fā)表。這篇文章是1985年穆里斯投給和被拒的文章，也是Cetus公司要求發(fā)表的兩篇文章之一。

1987年，才木等人在上發(fā)表了《使用擴(kuò)增單拷貝DNA的直接基因組測序表征β-地中海貧血突變》（Characterization of β-thalassaemiamutations using direct genomic sequencing of amplified single copy DNA）。在PCR中使用耐熱DNA聚合酶（Saiki等人準(zhǔn)備中的手稿），將PCR和擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析相結(jié)合應(yīng)用于人類單拷貝基因。

1988年，才木等人在上正式發(fā)表了《引物導(dǎo)向的酶促擴(kuò)增DNA與熱穩(wěn)定DNA聚合酶》，從棲熱菌中分離出來的DNA聚合酶極大地簡化PCR程序，并且擴(kuò)增反應(yīng)能夠在更高的溫度下進(jìn)行，顯著提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、產(chǎn)量、靈敏度和長度。1989年，將DNA聚合酶譽(yù)為“年度分子”。

1988年，?？怂沟热嗽谏习l(fā)表了《聚合酶鏈反應(yīng)以低成本實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化》（Poly?merase chain reaction automated at low cost），Cetus公司推出了第一臺PCR自動(dòng)儀，PCR實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

PCR技術(shù)從1985年正式發(fā)表以來，經(jīng)過兩三年發(fā)展，在1988年應(yīng)用得到井噴式增長。1985～1987年，發(fā)表文獻(xiàn)僅10篇，都是Cetus公司研究員所發(fā)表的，到1988年發(fā)表的文章達(dá)上百篇。紐約時(shí)報(bào)評價(jià)PCR技術(shù)將生物學(xué)劃分為PCR前時(shí)代和PCR后時(shí)代。

2.3 明確PCR技術(shù)發(fā)明時(shí)間

只有當(dāng)一個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)被開發(fā)出來時(shí)，PCR技術(shù)才能成為一個(gè)科學(xué)實(shí)體。穆里斯在1983年提出了多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的概念，在當(dāng)時(shí)僅僅是一種概念，并沒有成為一種技術(shù)。因此，1983年P(guān)CR技術(shù)并未真正誕生，當(dāng)時(shí)只是提出了多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的概念。值得一提的是，1971年發(fā)表的一篇文章中提到了雙引物系統(tǒng)和“修補(bǔ)復(fù)制”的概念，這是PCR的雛形，不過基于此的經(jīng)驗(yàn)思路沒有實(shí)現(xiàn)。

1985年，才木等人的《酶促擴(kuò)增β-珠蛋白基因組序列和限制性位點(diǎn)分析用于診斷鐮狀細(xì)胞性貧血》文章在上發(fā)表，代表著PCR技術(shù)的誕生?？茖W(xué)事實(shí)的一個(gè)重要特征就是可重復(fù)性，1985年之前的實(shí)驗(yàn)無法滿足重復(fù)性這一特征，也無法證實(shí)擴(kuò)增條帶的特異性，1985年的β-珠蛋白基因組序列的酶切擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃C實(shí)擴(kuò)增序列具有特異性，也具有重復(fù)性。穆里斯關(guān)于PCR的構(gòu)想終于在才木和法魯納等人的幫助下取得成功。

因此認(rèn)為1985年穆里斯等人發(fā)明了PCR技術(shù)。

3 PCR技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用

3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

最初的PCR技術(shù)通過凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行檢測，只能定性分析，不能定量分析。1992年，Higuchi開發(fā)了實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，開啟了PCR由定性到定量的應(yīng)用。在Higuchi等人DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)中，利用溴化乙錠（EtBr）結(jié)合到雙鏈DNA中，通過增強(qiáng)熒光信號來檢測每個(gè)PCR中DNA的積累，熱循環(huán)過程中熒光積累的動(dòng)力學(xué)與DNA拷貝的起始數(shù)量相關(guān)。這種方法分析特異性DNA序列，可在一定范圍內(nèi)定量檢測，一旦開始擴(kuò)增就不需要打開試管取樣，減少了所需的人工量，簡化了過程，降低了PCR產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前市場上最主流的PCR技術(shù)，成熟應(yīng)用于各種分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究之中，但依賴Cycle threshold值（簡稱CT，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)）的相對定量方式、靈敏度低等特征限制了其在很多臨床領(lǐng)域的應(yīng)用。

3.2 PCR的應(yīng)用

PCR技術(shù)目前在醫(yī)學(xué)診斷、食品檢測、農(nóng)業(yè)科學(xué)等許多方面均有廣泛應(yīng)用，是世界上所有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室最常規(guī)、基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。在病原體的檢測中，許多病原體已經(jīng)有相應(yīng)的PCR檢測試劑盒。這些試劑盒能高效率、敏感地找出潛伏病毒的存在。

在新冠疫情下，新冠核酸檢測已成為世界人民生活的一部分。目前的新冠病毒核酸檢測大多采用熒光定量PCR技術(shù)。將新型冠狀病毒核酸RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以新冠病毒的cDNA為靶基因，通過PCR擴(kuò)增，使這段靶DNA序列呈指數(shù)級增加，每一個(gè)擴(kuò)增出來的DNA序列都可與預(yù)先加入的一段熒光標(biāo)記探針結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號。擴(kuò)增出來的靶基因越多，累計(jì)的熒光信號就越強(qiáng)。因此，核酸檢測就是通過檢測熒光信號的累積來確定樣本中是否有病毒核酸。