楊 桐，田春洪，田 原，喬金麗，楊小潔

(云南省中醫(yī)中藥研究院，云南 昆明 650032)

再生障礙性貧血(Aplastic anermia，AA)是由于化學、物理及各種不明原因引起的骨髓造血功能衰竭，臨床上以較嚴重的貧血、出血和全血細胞減少為主要表現(xiàn)的綜合征[1-2]。現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)AA發(fā)病機制與輔助/誘導CD3+CD4+T細胞和細胞毒性CD3+CD8+T細胞(CTL)比例倒置、CD4+T細胞分化的Th1和Th2細胞平衡失調，以及骨髓抑制狀態(tài)和造血細胞的凋亡有關[3-5]。云南省中醫(yī)中藥研究院研究員，國醫(yī)大師張震根據(jù)臨床經(jīng)驗自擬益血生髓方治療非重型AA取得了良好的療效，但研究僅限于少量臨床觀察[6]。為使本方在臨床研究和應用中提供基礎，本研究以苯試劑化學誘導方法建立AA小鼠模型，通過觀察血細胞、T細胞亞群和骨髓病理學等變化情況探討益血生髓顆粒對AA小鼠造血及免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 近交系BALB/c小鼠，全雄，SPF級，體重17～22 g，斯貝福生物技術有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2019-0019。室溫18～20 ℃，飲用消毒滅菌水，食用Co60滅菌飼料。實驗經(jīng)云南省中醫(yī)中藥研究院動物實驗倫理委員會批準，編號：20210021。

1.2 藥物和試劑 益血生髓方顆粒(藥物組成：黃芪、補骨脂、菟絲子、淫羊藿、柴胡、鹿角膠、香附、郁金、枳實、白芍)由北京康仁堂制劑中心提供，批號210409；配方顆粒規(guī)格：12 g/袋。司坦唑醇片,批號20120036。苯試劑，分析純(AR≥99.5%)，貨號B803131。玉米油，藥用級，貨號8001-30-7。FITC-anti-mouse CD3、APC-anti-mouse CD4、FITC-anti-mouse IL-4、PE-anti-mouse CD8a和FITC-anti-mouse INF-γ為美國eBioscience公司生產(chǎn)。小鼠IL-2 ELISA試劑盒，武漢博士德生物公司生產(chǎn)。小鼠粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和小鼠巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)ELISA試劑盒，英國Abcam公司產(chǎn)品。

1.3 實驗儀器 流式細胞儀，美國BD LSRⅡ型。醫(yī)用凈化工作臺，CJ-2F型，馮氏實驗動物設備有限公司產(chǎn)品。82-1型電動離心機，上海醫(yī)用儀器廠。LD-96A酶標儀，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品。Kx-21血象分析儀，日本Sysmex產(chǎn)品。RM2135石蠟切片機，德國Leica公司產(chǎn)品。

1.4 動物分組、造模和給藥 采用隨機數(shù)字表法將72只SPF級BALB/c雄性小鼠分為正常對照組、AA模型組、司坦唑醇陽性對照組(陽性對照組)、益血生髓顆粒低劑量組(低劑量組)和益血生髓顆粒高劑量組(高劑量組)，正常對照組12只，其余各組15只，分籠飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。除正常對照組外，其余各組按文獻[7]方法造模。方法：AA模型組，低、高劑量組和陽性對照組小鼠，予苯試劑+玉米油(1∶1配制)，2 ml/kg (1 ml苯+1 ml玉米油均勻混合)，背部皮下注射，每周4次，持續(xù)7周，共注射28次。正常對照組小鼠予玉米油2 ml/kg，背部皮下注射，每周4次，持續(xù)7周，共注射28次。低、高劑量組小鼠予以益血生髓顆粒溶液灌胃15 d，按實驗動物和人的體表面積比值表折算小鼠等效灌胃劑量[8]，將12 g配方顆粒均勻溶于120 ml蒸餾水，過濾濃縮至120 mg/ml備用，低劑量組小鼠用藥1.2 g/(kg·d)，高劑量組小鼠用藥4.8 g/(kg·d)。陽性對照組灌胃司坦唑醇混懸液2 mg/(kg·d)，持續(xù)15 d。正常對照組和AA模型組小鼠予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃15 d，各組給藥體積均為0.2 ml/10 g。

1.5 檢測指標

1.5.1 外周血血細胞骨髓有核細胞數(shù)(BMNC)：每組各取10只小鼠頜下靜脈采血約0.2 ml，置15%EDTA-K2抗凝的EP管中混勻，血常規(guī)分析儀測白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)。取血結束后CO2窒息法安樂死小鼠，手術取右側股骨，制備骨髓細胞混懸液，取20 μl細胞混懸液加入紅細胞裂解液后在顯微鏡下計算BMNC的數(shù)量。

1.5.2 T淋巴細胞亞群：每組各取8只小鼠頜下靜脈采血放入1.5 ml EP管中，1000 r/min，離心10 min，將血漿吸入流式管中，每個流式管中加入2 ml RBC裂解液，1000 r/min離心5 min，每管加入含1% FBS 2 ml，1000 r/min離心5 min，計算體積后每管加20 μl的CD4-APC(0.2 μg/μl)，CD8a-PE(0.2 μg/μl)和CD3-FITC(0.5 μg/μl)抗體，避光孵育20 min，加2 ml 1% FBS，1000 r/min離心5 min，加入300 μl的1% FBS液，流式細胞儀檢測外周血T細胞亞群在淋巴細胞中的百分數(shù)。小鼠外周血取樣結束后，CO2處死，超凈工作臺下無菌取脾，鈍頭剪刀除去白色結締組織，放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中。彎頭手術剪將脾切成約3 mm數(shù)個小塊，將脾臟組織置于鐵質濾網(wǎng)，均勻研磨經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用PBS將濾網(wǎng)上粘連的脾臟細胞沖洗2次，將細胞懸液1000 r/min離心10 min制成脾細胞懸液，1 ml懸液加入10 μl抗體檢測，F(xiàn)ITC-anti-mouse INF-γ標記Th1細胞，F(xiàn)ITC-anti-mouse IL-4標記Th2細胞，室溫避光孵育30 min，1500 r/min離心8 min后加入0.4 ml PBS流式細胞儀檢測脾臟Th1和Th2細胞百分數(shù)[9]。

1.5.3 ELISA檢測IL-2、G-CSF和M-CSF：每組各取10只或8只小鼠頜下靜脈采集外周血，室溫放置20 min后，2500 r/min離心5 min，取血清放置-80 ℃冰箱保存。檢測前提前30 min將樣品從冰箱取出恢復室溫，按小鼠IL-2、小鼠G-CSF和小鼠M-CSF ELISA檢測試劑盒上的步驟說明操作，用酶標儀在終止反應5 min內讀取450 nm的吸光度(OD)值，保存數(shù)據(jù)通過繪制標準曲線在坐標上找出對應的濃度，計算血清IL-2、G-CSF和M-CSF水平。

1.5.4 HE染色骨髓病理學： 取小鼠左側股骨，10%福爾馬林固定24 h，再用Von Ebeners液(飽和氯化鈉水溶液50 ml，蒸餾水50 ml，濃鹽酸8 ml)骨組織脫鈣2 d，包埋、切片后將切片浸入二甲苯Ⅰ溶液中10 min，后放入二甲苯Ⅱ溶液浸入10 min，依次將切片放入梯度乙醇中各5 min，流動水沖洗切片約3 min；然后蘇木素染色5 min，流動水沖洗將組織從甘紫色變?yōu)樗{色，使用鹽酸乙醇分化數(shù)秒后伊紅染色4 min。染色處理完成后將切片依次放入上行梯度乙醇中，分次約5 min脫水。后將切片分別浸入二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ中各5 min透明處理，使用樹脂封片，HE染色后在顯微鏡下進行骨髓病理學分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0、Graph Pad Prism 8.0.1統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)若正態(tài)分布使用LSD-t檢驗，一組呈偏態(tài)分布用Mann-Whitney U檢驗；多組數(shù)據(jù)間若正態(tài)分布且方差齊用單因素方差分析(ANOVA)，不滿足則采用Kruskal-Wallis H檢驗；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況 與正常對照組小鼠對比，AA模型組小鼠出現(xiàn)體重和食欲減輕，神疲少動，毛發(fā)枯黃，爪甲蒼白，偶發(fā)便血等表現(xiàn)，且隨苯試劑給藥次數(shù)增加而愈發(fā)明顯。實驗結束前，正常對照組小鼠死亡1只，AA模型組死亡小鼠2只，其余各組死亡小鼠共4只。

2.2 各組小鼠外周血血細胞數(shù)量比較 AA模型組小鼠外周血血細胞WBC、RBC、HGB、PLT均低于正常對照組(P<0.05)，說明苯試劑誘導的造模方法導致小鼠造血功能受損，骨髓抑制并造成血細胞計數(shù)顯著降低。經(jīng)益血生髓顆粒和司坦唑醇治療后，低、高劑量組和陽性對照組血細胞WBC、RBC、HGB、PLT均高于模型組(P<0.05),高劑量組對RBC和PLT的提升作用高于陽性對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠外周血WBC、RBC、HGB、PLT細胞數(shù)量比較

2.3 各組小鼠血清IL-2及股骨BMNC數(shù)量比較 見表2。 AA模型組血清IL-2濃度高于正常對照組(P<0.05)，低、高劑量組和陽性對照組血清IL-2濃度低于AA模型組(P<0.05)，低、高劑量組和陽性對照組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AA模型組小鼠BMNC數(shù)量顯著低于正常對照組(P<0.05)，低、高劑量組和陽性對照組小鼠BMNC數(shù)量均顯著高于AA模型組(P<0.05)，高劑量組BMNC數(shù)量高于低劑量組(P<0.05)，低劑量組和陽性對照組小鼠的BMNC數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠血清IL-2和股骨BMNC數(shù)量比較

2.4 各組小鼠血清G-CSF和M-CSF水平比較 見表3。各組小鼠血清G-CSF和M-CSF濃度均顯著低于正常對照組(P<0.05)，高劑量組G-CSF濃度大于低劑量組(P<0.05)，而M-CSF的濃度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠血清G-CSF和M-CSF水平比較(pg/ml)

2.5 各組小鼠外周血和脾臟T淋巴細胞亞群比較 見表4、5。與正常對照組比較，AA模型組小鼠外周血CD3+CD4+T顯著降低，CD3+CD8+T顯著升高，CD4+/CD8+比值顯著降低(P<0.05)，與AA模型組比較，低、高劑量組和陽性對照組CD3+CD4+T升高，CD3+CD8+T降低，CD4+/CD8+比值升高(P<0.05)。高劑量組CD3+CD4+T與低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，CD3+CD8+T低于低劑量組(P<0.05)，CD4+/CD8+比值高于低劑量組(P<0.05)。AA模型組小鼠脾臟Th1細胞和Th2細胞與正常對照組比較差異顯著(P<0.05)；陽性對照組Th1細胞百分率高于AA模型組(P<0.05)，低、高劑量組和陽性對照組Th2細胞百分數(shù)低于AA模型組(或P<0.05)。

表4 各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群比較

2.6 各組小鼠股骨骨髓病理學情況 正常對照組小鼠股骨骨髓造血組織結構完整，骨髓增生活躍，骨髓有核細胞正常，造血細胞在髓腔中分布均勻且數(shù)量豐富。AA模型組小鼠骨髓增生程度減低，造血組織面積明顯減少，非造血組織增多，可見脂肪組織填充，骨髓有核細胞減少，髓腔內血竇擴張。低劑量組、高劑量組和陽性對照組骨髓增生程度較AA模型組出現(xiàn)不同程度恢復，脂肪細胞減少，較正常對照組骨髓有核細胞減少。高劑量組骨髓增生程度較低劑量組和陽性對照組高(圖1)。

表5 各組小鼠脾臟Th1、Th2細胞比較(%)

A：正常對照組；B：AA模型組；C：低劑量組；D：高劑量組；E：陽性對照組

3 討 論

血之生成與五臟功能有關，最重要的是先天之本腎與后天之本脾，髓為腎所生，受腎氣的充養(yǎng)，古籍對其生血與造血關系提及較少，在《張氏醫(yī)通·諸血門》提到氣與血兩者“總由水谷所化，其始也渾然一體未分清濁，得脾氣之鼓云，如霧上蒸于肺而為氣；氣不耗歸精于腎而為精，精不泄歸精于肝而為清血”，并歸結說血之化成“實不離五行之氣化”。由于血與氣是人體陰與陽的代表，氣血相生且密切相關，只有氣機保持調暢，才能擁有充沛的血液濡養(yǎng)周身。國醫(yī)大師張震認為再生障礙性貧血的治療法則應遵循“謹守病機、各司其屬”的原則，調護患者先后天之本，遵循“一體兩翼”治療方法，即以肝為主體，脾腎為兩翼，促進肝之疏泄條達，氣機調暢功能，并顧護脾腎先后天之本。張老自擬的益血生髓湯(又名疏調生血湯)，以調暢氣機為核心，兼以調護脾腎，起到養(yǎng)血生血、疏肝補腎、健脾強髓的作用。臨床實踐中還應根據(jù)患者實際病情，發(fā)揮中醫(yī)辨證論治優(yōu)勢，針對其繼發(fā)證候或兼夾證候，采用相應治法。

AA動物模型方法包括物理、化學和免疫介導等，目前免疫介導的AA模型應用較多，方法為取DBA/2小鼠胸腺淋巴結細胞懸液輸注經(jīng)6.0 Gy60Coγ射線全身均勻照射的BALB/c小鼠尾靜脈中[10]，該方法造模成功率高，但有文獻[11]報道動物死亡率高，原因可能與放射劑量實踐中難以控制和造模后動物骨髓重度衰竭有關。對于需要較長時間給藥治療的研究，應用免疫誘導方法AA造模，造模后小鼠的生存期可能無法維持到藥物給藥結束。化學誘導的AA模型常用環(huán)磷酰胺、白消安、氯霉素、苯試劑等，單純用苯試劑誘導的AA模型，方法簡單，成本較低，苯通過其毒性代謝產(chǎn)物導致骨髓造血微環(huán)境和造血功能的抑制，造模后動物生存時間較免疫誘導方法較長，AA模型與臨床慢性AA表現(xiàn)有相似點，能夠滿足需要一定時間的中藥藥效實驗要求。缺點為造模周期長，研究顯示苯試劑介入至少25次(2 mg/kg)AA模型小鼠各種血細胞數(shù)量才能明顯減少[12]。Faiola等[13]研究發(fā)現(xiàn)雄性小鼠對苯試劑敏感性高于雌性小鼠，故本研究動物全部選用了雄性小鼠，通過對AA組小鼠血細胞、BMNC、G-CSF、M-CSF等與正常對照組的比較，苯試劑誘導的AA模型方法是穩(wěn)定有效的。

T細胞又稱T淋巴細胞，T細胞可進一步分為輔助/誘導T細胞(CD3+CD4+T)、抑制/細胞毒性T細胞(CD3+CD8+T)、功能亞群(CD25+)和凋亡亞群(CD95+)等， CD4+T細胞根據(jù)分泌因子不同可分為Th1和Th2兩個亞群[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)AA的發(fā)病機制與T淋巴細胞介導的造血功能抑制聯(lián)系緊密[17]，表現(xiàn)為CD3+CD4+T細胞降低，CD3+CD8+T細胞升高，CD4+/CD8+比值倒置和Th1/Th2細胞比例失衡造成的免疫紊亂是關鍵因素[18-19]，INF-γ誘導的Th1細胞可釋放IL-2、INF-γ等細胞因子，Th2細胞分泌IL-4、IL-5等細胞因子，CD8+CTL細胞釋放穿孔素、顆粒酶對造血干細胞持續(xù)破壞，導致骨髓造血功能重度抑制并使血細胞減少[20-21]。集落刺激因子G-CSF和M-CSF是血細胞增殖分化中必需的刺激因子，可促進造血干細胞分化和增殖，刺激巨噬細胞、粒細胞成熟，增加外周血細胞的數(shù)量。實驗研究結果顯示益血生髓顆粒對AA小鼠具有一定免疫調節(jié)作用，表現(xiàn)為低、高劑量組與AA模型組比較，外周血CD3+CD8+T細胞降低和CD3+CD4+T細胞升高，CD4+/CD8+比值升高；高劑量組效果優(yōu)于低劑量組，可降低脾臟Th1細胞百分數(shù)和血清IL-2水平，而陽性對照組也具有相同作用。陽性對照組Th2細胞百分數(shù)高于AA模型組，低、高劑量組對Th2細胞的影響則不明顯。低、高劑量組可提高AA模型小鼠外周血血細胞WBC、RBC、HGB、PLT和骨髓BMNC數(shù)量，高劑量組可提高集落刺激因子G-CSF和M-CSF濃度。股骨骨髓病理學顯示益血生髓治療組的骨髓細胞數(shù)、骨髓造血環(huán)境較AA模型組有改善，說明益血生髓顆?？赡芡ㄟ^調節(jié)集落刺激因子水平，促進造血組織增生和造血干細胞增殖，刺激血細胞成熟并增加外周血血細胞和骨髓有核細胞數(shù)量，起到一定程度造血恢復作用，其詳細機制具有進一步研究價值。綜上所述，益血生髓顆粒對AA小鼠具有一定免疫調節(jié)作用和骨髓造血功能抑制改善作用。