段小云，萬 軍，曾琳琳，沈 靈，吳傳紅，仲瑞雪

(1.四川省骨科醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610041；2.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031)

深靜脈血栓(Deep venous thrombosis,DVT)好發(fā)于骨科術(shù)后，有研究指出，在無預(yù)防措施前提下，普通外科術(shù)后DVT發(fā)生率為10%～40%[1]。股骨血管網(wǎng)豐富且密集，股骨骨折術(shù)后需長期臥床，下肢活動(dòng)明顯減少，易并發(fā)DVT[2]。對此，有研究發(fā)現(xiàn)[3]，給予骨科大手術(shù)患者預(yù)防性抗凝措施，可使DVT發(fā)生率及病死率顯著降低，對患者術(shù)后轉(zhuǎn)歸有積極作用。利伐沙班是目前骨科大手術(shù)預(yù)防DVT的常用藥物，改善凝血功能效果顯著[4]。中醫(yī)辨證施治個(gè)性化治療特色，患者接受度較高，一些在長期臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上形成的經(jīng)驗(yàn)方、保密方和協(xié)定方，具有獨(dú)特的療效[5]。靜脈血栓方為本院用于防治下肢靜脈血栓的經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效確切，不良反應(yīng)少。但靜脈血栓方對DVT的防治效果及作用機(jī)制需要更深入的研究?；诖?，本研究分析靜脈血栓方與利伐沙班對大鼠股骨骨折模型的干預(yù)效果，為靜脈血栓方臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司的SPF級大鼠36只，體重220～300 g，雌雄不拘，合格證號：SCXK(川)2020-030，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，室溫(24±2)℃，濕度60%～65%，自由飲水、進(jìn)食。本研究經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物、試劑及儀器：靜脈血栓方由黃芪60 g，黨參、丹參各30 g，當(dāng)歸尾15 g，赤芍、桃仁、紅花、水蛭、三七、川芎各12 g組成，由四川省骨科醫(yī)院藥學(xué)部統(tǒng)一購買并煎制，藥材有固定的產(chǎn)地和中藥質(zhì)控。制備方法：藥材準(zhǔn)確稱量，加水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，過濾后將兩次濾液混合，根據(jù)《藥理與中藥藥理實(shí)驗(yàn)》[6]制定靜脈血栓方的劑量，分別煎煮至含生藥量為4.48、2.24、1.12 g/ml。陽性藥物為利伐沙班片(H20181081，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，10 mg/片)。蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色液及戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司；酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自美國CUSABIO公司，黃嘌呤氧化酶試劑盒及硫代巴比妥酸試劑盒購自北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司；普通光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，型號為CX-21；全自動(dòng)凝血分析儀購自日本SYSMEX公司，型號為CS-5100。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及造模：將36只大鼠分為空白對照組、模型對照組、陽性藥物組及高劑量組、中劑量組、低劑量組(隨機(jī)數(shù)字表簡單隨機(jī)分組法)，每組6只。除空白對照組外，其他五組共30只大鼠行機(jī)械損傷性造模成股骨骨折模型，稱重后，給予1%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔麻醉，使大鼠取仰臥位，消毒、鋪巾，雙下肢屈髖屈膝固定；在腹股溝外側(cè)縱行切開1 cm，分離皮下組織，顯露股骨，使用無菌止血鉗夾住股骨兩端并向相反方向旋轉(zhuǎn)，當(dāng)聽到啪的聲響時(shí)，檢查股骨干，股骨完整性結(jié)構(gòu)破壞，即確定為造模成功；造模后用1號絲線全層間斷縫合切口，另一側(cè)使用相同方法處理，造模后大鼠正常飼養(yǎng)，未使用抗生素。

1.2.2 給藥：在造模前7 d與造模后7 d期間對各組大鼠灌胃，陽性藥物組給予利伐沙班片11.1 mg/(kg·d)灌胃，空白對照組、模型對照組采用等體積蒸餾水灌胃，高劑量組、中劑量組、低劑量組分別按照靜脈血栓方各劑量以1 ml/100 g灌胃，1次/d。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

1.3.1 凝血指標(biāo)：于造模后7 d，取各組大鼠尾靜脈血，使用全自動(dòng)凝血分析儀檢測活化部分凝血活酶時(shí)間(Activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原時(shí)間(Prothrombin time,PT)、凝血酶時(shí)間(Thrombin time,TT)及D-二聚體(D-dimer,DD)。

1.3.2 炎癥指標(biāo)：將各組大鼠尾靜脈血以3000 r/min離心20 min(離心半徑10 cm)，取上層清液，采用酶聯(lián)免疫分析法檢測血清腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)水平。

1.3.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)：采用黃嘌呤氧化酶試劑盒檢測血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)水平，采用硫代巴比妥酸法檢測血清丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平。

1.3.4 HE染色標(biāo)本：于造模后7 d，1%戊巴比妥納1 ml/kg腹腔麻醉后處死，取各組大鼠左大隱靜脈組織標(biāo)本，使用75%、80%、90%、95%、100%乙醇各脫水1 h，石蠟包埋，切成4 μm石蠟切片；石蠟切片再次采用梯度乙醇脫水，行HE染色，脫水封邊，送至電鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠基本狀況 各組大鼠生長良好，除空白對照組外，造模的五組大鼠在造模當(dāng)日飼料食用量減少，活動(dòng)量明顯減少，但造模后第2天飲食情況逐漸恢復(fù)正常，活動(dòng)量較造模當(dāng)日增加，但與空白對照組大鼠比較仍較少。

2.2 各組大鼠凝血指標(biāo)比較 見表1。造模后7 d，造模的五組PT、APTT、TT均較空白對照組顯著降低(P<0.05)，DD 則較空白對照組顯著升高(P<0.05)；模型對照組PT低于陽性藥物組、中劑量組與高劑量組(P<0.05)，APTT、TT低于陽性藥物組、低劑量組、中劑量組與高劑量組(P<0.05)，DD 則高于陽性藥物組、低劑量組、中劑量組與高劑量組(P<0.05)；陽性藥物組PT、APTT、TT均高于低劑量組、中劑量組(P<0.05)，DD則低于低劑量組、中劑量組(P<0.05)；各劑量組PT、APTT、TT均隨劑量的升高而升高(P<0.05)，DD則隨劑量的升高而降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠PT、APTT、DD、TT比較

2.3 各組大鼠炎癥指標(biāo)比較 見表2。造模后7 d，除陽性藥物組外其他造模的四組血清TNF-α、IL-6水平均較空白對照組顯著升高(P<0.05)；模型對照組血清TNF-α、IL-6水平均高于陽性藥物組及低劑量組、中劑量組、高劑量組(P<0.05)，陽性藥物組則低于低劑量組、中劑量組(P<0.05)，各劑量組血清TNF-α、IL-6水平隨劑量的升高而降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6比較(pg/ml)

2.4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表3。造模后7 d，除陽性藥物組外其他造模的四組血清SOD水平較空白對照組顯著降低(P<0.05)，模型對照組低于陽性藥物組及低劑量組、中劑量組、高劑量組(P<0.05)，陽性藥物組血清SOD水平高于低劑量組(P<0.05)，低劑量組血清SOD水平低于高劑量組(P<0.05)；造模的五組血清MDA水平均較空白對照組升高(P<0.05)，模型對照組血清MDA水平高于陽性藥物組及低劑量組、中劑量組、高劑量組(P<0.05)，陽性藥物組則低于低劑量組、中劑量組(P<0.05)，各劑量組血清MDA水平隨劑量的升高而降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清SOD、MDA比較

2.5 各組大鼠HE染色標(biāo)本比較 空白對照組大鼠靜脈血管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤；模型對照組見血栓形成，靜脈內(nèi)膜損傷，血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)剝脫現(xiàn)象，血管壁炎性細(xì)胞浸潤；陽性藥物組及高劑量組未見明顯血栓形成改變，但存在少量血管壁炎性細(xì)胞浸潤；低劑量組及中劑量組可見血栓形成及血管壁炎性細(xì)胞浸潤，但病理變化小于模型對照組(圖1)。

A:空白對照組；B:模型對照組；C:陽性藥物組；D:低劑量組；E:中劑量組；F:高劑量組

3 討 論

DVT在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)佟肮赡[”“腫脹”“血瘀”等范疇，國家中醫(yī)藥管理局于1994年將DVT正式命名為“股腫”[7]?！端貑枴け哉撈分刑岬剑栽谟诿}則血凝而不流。《備急千金要方》指出，氣血凝滯則為痛，脈道阻塞則為腫。久病氣虛，氣虛則推動(dòng)無力，血行受阻，血瘀痹阻于脈，脈絡(luò)不暢則營血回流受阻，津液外溢而生濕，濕熱、瘀血互結(jié)阻于脈絡(luò)，故DVT以濕、熱、瘀相互為患，脈絡(luò)血瘀濕阻為主要病機(jī)[8-9]。因此，DVT的中醫(yī)治療應(yīng)使用益氣活血、清熱化瘀法。靜脈血栓方中黃芪益氣為君，甘溫補(bǔ)氣，氣血充足，則血行通暢；赤芍清熱涼血，散瘀止痛，二者相須為用，能清血分實(shí)熱、虛熱，散瘀血而留滯[10]。紅花、桃仁，一溫一平，同入心、肝經(jīng)，有活血祛瘀之功，為活血祛瘀之經(jīng)典藥對[11-12]。當(dāng)歸尾功擅活血，為養(yǎng)血之要藥；丹參歸心、肝經(jīng)，長于清心涼血、活血祛瘀、通經(jīng)止痛，能清肝經(jīng)之瘀，除心經(jīng)之煩[13]。《神農(nóng)本草經(jīng)》謂水蛭有“主逐惡血、破瘀血”之效，《本草求真》謂三七“氣味甘苦，能于血分化其血瘀”，兩味合用使瘀血祛、新血生。佐以黨參，益氣健脾，以防活血祛瘀藥之性烈，顧護(hù)正氣，又取其“氣能攝血”之效，防止出血之弊；川芎行氣活血，使諸藥補(bǔ)而不滯[14]。全方有陰有陽，通中有補(bǔ)，溫涼并濟(jì)，攻補(bǔ)兼顧，動(dòng)靜結(jié)合，破而不伐，補(bǔ)而不滯，具有活血祛瘀生新之功效，使?fàn)I衛(wèi)恢復(fù)周流無阻。

本研究對大鼠行機(jī)械損傷性造模，形成股骨骨折模型，在造模前、后共14 d內(nèi)行灌胃干預(yù)，發(fā)現(xiàn)模型對照組靜脈管腔內(nèi)血栓形成，且伴靜脈內(nèi)膜損傷、血管內(nèi)皮細(xì)胞剝脫及血管壁炎性細(xì)胞浸潤，提示股骨骨折術(shù)后DVT形成。另外，低劑量組及中劑量組大鼠也可見血栓形成及血管壁炎性細(xì)胞浸潤，但血栓體積及靜脈血管形態(tài)損傷小于模型對照組，提示低、中劑量的靜脈血栓方對防治DVT有一定療效。且陽性藥物組與高劑量組靜脈組織標(biāo)本圖像相近，均存在少量血管壁炎性細(xì)胞浸潤，但未見管腔內(nèi)血栓，提示高劑量靜脈血栓方對DVT的防治效果與常規(guī)西藥利伐沙班相當(dāng)。這也說明，靜脈血栓方可發(fā)揮其益氣活血、清熱化瘀、祛瘀生新之功，糾正血瘀濕阻之證，使脈絡(luò)通暢無阻、營衛(wèi)氣血周流恢復(fù)，而減少DVT形成，且高劑量對DVT防治效果最好，可與常規(guī)西藥媲美。

此外，本研究還就DVT形成機(jī)制展開分析，發(fā)現(xiàn)模型對照組APTT、TT低于陽性藥物組及各高劑量組，DD 則高于陽性藥物組及各劑量組，提示股骨骨折術(shù)后血液處于高凝狀態(tài)。而各劑量組PT、APTT、TT均隨劑量的升高而升高，DD則隨劑量的升高而降低，陽性藥物組與高劑量組凝血指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高劑量靜脈血栓方的抗凝效果與利伐沙班相當(dāng)。現(xiàn)代藥理學(xué)表明[15]，黃芪可降低血小板黏附率，改善血液流變學(xué)，川芎抑制血小板聚集，目前在抗血栓治療中常用。這也可能是靜脈血栓方抗凝效果顯著的原因。炎癥及氧化應(yīng)激也參與DVT形成，全身炎癥反應(yīng)可激活凝血系統(tǒng)，引起血栓形成；氧化應(yīng)激的顯著增強(qiáng)也能損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血小板黏附，加速血栓形成[16-17]。本研究中，模型對照組血清TNF-α、IL-6及MDA水平高于陽性藥物組及各劑量組，各劑量組隨劑量的升高而降低；模型對照組血清SOD水平低于陽性藥物組及各劑量組，低劑量組則低于高劑量組；且高劑量組與陽性藥物組上述指標(biāo)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示靜脈血栓方還具有抗炎、抗氧化應(yīng)激作用，且高劑量靜脈血栓方的抗炎、抗氧化應(yīng)激效果與利伐沙班相近[18]?？紤]與紅花、三七、赤芍等中藥材具有抗炎、抗氧化作用，對抑制炎癥、減輕氧化應(yīng)激具有良好功效有關(guān)[19-20]。

綜上所述，靜脈血栓方對防治股骨骨折術(shù)后DVT療效良好，可通過抗凝、抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用減少血栓形成，且高劑量靜脈血栓方療效肯定，能進(jìn)一步降低患者血栓風(fēng)險(xiǎn)。