劉永濤，張文芳，覃仕揚(yáng)，喬 靜，楊士云，孫全剛

（1. 北京市公安司法鑒定中心，法庭毒物分析公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192；2. 北京市豐臺(tái)區(qū)公安司法鑒定中心，北京 100071）

口服降糖藥主要包括磺酰脲類、格列奈類、雙胍類、噻唑烷二酮類、α-糖苷酶抑制劑等治療藥物。降血糖藥在控制血糖的同時(shí)常引發(fā)一些藥品不良反應(yīng)[1]，有些甚至可以導(dǎo)致死亡。目前，不法分子利用降血糖藥物實(shí)施犯罪導(dǎo)致受害人低血糖休克甚至死亡的刑事案件，以及利用降血糖藥物自殺的案件時(shí)有發(fā)生，尤其是磺酰脲類降血糖藥物，因此，降糖藥的檢測(cè)需列入到毒物檢測(cè)的常見范圍。當(dāng)前，亟需建立一種靈敏度較高、能同時(shí)檢驗(yàn)多種常用降血糖藥物的檢測(cè)方法，補(bǔ)充法醫(yī)毒物對(duì)非正常死亡案件中死者生物檢材中降血糖藥物常規(guī)檢測(cè)空白,從而為相關(guān)非正常死亡案件死因判斷提供一定的判斷依據(jù)。降血糖類化合物的檢測(cè)方法包括免疫法[2]、拉曼光譜法[3-4]、薄層色譜法[5-8]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[9-11]等，由于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，是司法鑒定實(shí)驗(yàn)室選用的最佳檢測(cè)技術(shù)。目前液相色譜質(zhì)譜法檢測(cè)多種類降糖藥針對(duì)的檢材多為中藥材和保健品[12-18]，對(duì)于血液中的降糖藥多為單類降糖藥的檢測(cè)[10-11]，國(guó)內(nèi)同時(shí)對(duì)多類降糖藥進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜檢測(cè)的報(bào)道較少，尿液的相關(guān)報(bào)道更為少見。

本研究采用乙腈沉淀蛋白法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS），建立了二甲雙胍、維達(dá)列汀、苯乙雙胍、羅格列酮、西他列汀、吡格列酮、甲苯磺丁脲、妥拉磺脲、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、格列美脲、那格列奈、格列喹酮、瑞格列奈等4類15種常用降血糖藥物在血液和尿液中的快速檢測(cè)方法，方法簡(jiǎn)便快捷、靈敏準(zhǔn)確、重復(fù)性好，完全滿足日常檢測(cè)，能為臨床中毒檢測(cè)及司法鑒定提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

UltiMate 3000型超高效液相色譜（美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）；TSQ Endura三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）。

甲醇、乙腈、甲酸和乙酸銨（色譜純，中國(guó)Dikma公司）；二甲雙胍、維達(dá)列汀、苯乙雙胍、羅格列酮、西他列汀、吡格列酮、甲苯磺丁脲、妥拉磺脲、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、格列美脲、那格列奈、格列喹酮、瑞格列奈等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%；中國(guó)Dikma公司）；去離子水（“屈臣氏”純凈水）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取二甲雙胍、維達(dá)列汀、苯乙雙胍、羅格列酮、西他列汀、吡格列酮、甲苯磺丁脲、妥拉磺脲、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、格列美脲、那格列奈、格列喹酮、瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并配制成1.0、0.01、0.001 mg/mL三種濃度的單標(biāo)和混標(biāo)溶液。

1.3 樣品前處理

移取血液、尿液等液體樣品1.0 mL，于15 mL具蓋離心管中，加入乙腈3.0 mL，混勻后，超聲10 min后，不低于10 000 r/min離心5 min，取上清液，用有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm, 3.5 μm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相A：5 mmol/L乙酸銨和甲酸緩沖水溶液（稱取乙酸銨0.384 g，加入800 μL甲酸，加水溶解稀釋至1 000 mL，pH值約為3），流動(dòng)相B：0.1%的甲酸甲醇；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；洗脫方式：梯度洗脫，梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions for liquid chromatography

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子模式掃描；檢測(cè)方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；噴霧電壓：3 500 V；加熱（蒸發(fā)）溫度：350 ℃；鞘氣及壓力：氮?dú)猓?8 psi；碰撞氣及壓力：氬氣，1.5 mTorr；輔助氣及壓力：氮?dú)猓?0 arb；離子傳輸管溫度：350 ℃（見表2）。

表2 15種化合物的保留時(shí)間、母離子、子離子、射頻電壓（RF）和碰撞能量（CE）Table 2 Retention time, precursor ions, product ions, RF voltages and collision energies about the 15 compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)利用15種化合物的空白添加樣品分別對(duì)乙腈-水和甲醇-水作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果甲醇-水響應(yīng)值高于乙腈-水。對(duì)有機(jī)相分別不添加甲酸和添加0.1%甲酸，水相添加0.1%甲酸（pH≈2.5）、0.1% 乙酸銨（pH≈3.5）、5 mmol/L的乙酸銨和甲酸緩沖液（pH≈3），結(jié)果以0.1%甲酸甲醇和5 mmol/L的乙酸銨和甲酸緩沖液作為流動(dòng)相，使得妥拉磺脲、維達(dá)列汀的響應(yīng)值明顯得到提升，并且可以使本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的15種降糖藥物達(dá)到良好的分離效果，響應(yīng)值較高。在優(yōu)化的色譜條件下，15種化合物的SRM色譜圖見圖1，色譜峰相對(duì)應(yīng)化合物見表2。

2.2 樣品前處理方法的考察

本實(shí)驗(yàn)對(duì)血液和尿液檢材采用乙腈沉淀蛋白和Oasis?PRIME HLB固相萃取柱的兩種前處理方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)二者提取回收率和檢出限基本相當(dāng)，所以選擇乙腈沉淀蛋白法。同時(shí)也對(duì)檢材超聲時(shí)間進(jìn)行了比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行10 min超聲時(shí)，回收率最高。乙腈沉淀蛋白法操作簡(jiǎn)單、快捷，并且節(jié)約成本，完全滿足實(shí)際辦案需要。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

利用15種濃度為0.001 mg/mL的化合物單標(biāo)溶液，對(duì)每一種化合物分別進(jìn)行分析，分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描，利用儀器自帶軟件進(jìn)行自動(dòng)篩選優(yōu)化母離子及子離子，選取相對(duì)豐度較高的兩個(gè)離子分別作為定量和定性離子，并在SRM模式下對(duì)響應(yīng)最弱的一種化合物進(jìn)行噴霧電壓、離子源溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，15種化合物在正離子模式下響應(yīng)強(qiáng)度和峰形都優(yōu)于負(fù)離子模式。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系

分別對(duì)空白血液和尿液進(jìn)行0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL的添加，進(jìn)行樣品前處理后，以化合物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的添加濃度為橫坐標(biāo)（x，ng/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，15種藥物在血液和尿液中在低濃度（0.5~10 ng/mL）至高濃度（200~1 000 ng/mL）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2均大于0.998，見表3。

2.4.2 方法檢出限

分別對(duì)空白血液和尿液進(jìn)行0.5、1、2、5、10 ng/mL的樣品添加后，對(duì)15種化合物記錄峰面積并計(jì)算信噪比，信噪比（S/N）數(shù)值在50左右時(shí)，作為該15種化合物在血液和尿液的定性檢出限（表3），除二甲雙胍在尿液中檢出限為5 ng/mL，其他14種藥物的檢出限均低于2 ng/mL，考慮二甲雙胍應(yīng)該與基質(zhì)影響有關(guān)，如案件需要，可以適當(dāng)增加檢材量或?qū)腿∫哼M(jìn)行濃縮后檢測(cè)。

表3 15種化合物的線性方程、R2和檢出限Table 3 Linear equations, correlation coefficients and detection limits of the 15 compounds

2.4.3 提取回收率

分別對(duì)空白血液和尿液進(jìn)行5、50、100和10、50、100 ng/mL的添加，按1.3前處理方法進(jìn)行樣品前處理，除二甲雙胍提取回收率為28.1%~42.9%，其他14種降糖藥物提取回收率為60.8%~119.0%之間（表4）。這與Lam等[19]研究報(bào)道二甲雙胍在尿液中提取回收率較低相印證，其利用Oasis?HLB 固相萃取柱萃取，提取回收率為24%。由于二甲雙胍服用劑量較大，副作用較小，通常每次用量范圍為250~1000 mg，用此檢測(cè)方法對(duì)臨床服用該藥物人員血液及尿液進(jìn)行了檢驗(yàn)，效果良好，完全可以滿足實(shí)際案例檢測(cè)要求。

2.4.4 方法精密度

分別對(duì)空白血液和尿液進(jìn)行5、50、100 ng和10、50、100 ng的添加，按1.3前處理方法進(jìn)行樣品前處理，每個(gè)樣品分別連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)進(jìn)樣3 d，分別記錄峰面積，結(jié)果表明各化合物峰面積日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）均不高于8.9%（見表 4）。

表4 15種化合物在血液和尿液中的提取回收率和精密度Table 4 Recoveries and precisions of the 15 compounds in blood and urine

3 結(jié)論

本研究針對(duì)司法鑒定中常規(guī)生物檢材血液和尿液，建立了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定15種降血糖藥物的分析方法。本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，擴(kuò)展了常規(guī)臨床中毒檢測(cè)及司法鑒定藥物檢測(cè)范圍，為利用降糖藥自殺或犯罪的治安案件及刑事案件提供技術(shù)支持。