余 平 李 晴

武漢市第三醫(yī)院/武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院1急診科，2心肺功能科 湖北 武漢 430060

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）在我國(guó)發(fā)病患病均高，已經(jīng)成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，我國(guó)CKD 患者總患病率接近10%［1］。隨著病程進(jìn)展，CKD 患者會(huì)最終進(jìn)展為終末期腎臟病，并常并發(fā)心血管疾?。?，3］。心、腎作為控制機(jī)體有效循環(huán)和血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的兩個(gè)重要器官，生理和病理狀態(tài)均存在相互依存現(xiàn)象［4］。心肌損害會(huì)大幅增加死亡等不良預(yù)后的發(fā)生概率，比如心室肥厚缺血會(huì)引發(fā)心律失常進(jìn)而增加心源性猝死的風(fēng)險(xiǎn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示，在我國(guó)各種原因?qū)е碌淖笮氖曳屎?、心力衰竭發(fā)生率近年來(lái)一直呈現(xiàn)升高趨勢(shì)；對(duì)于CKD 患者人群，早期評(píng)估心血管病變以及進(jìn)行療效判斷提供更簡(jiǎn)便、低創(chuàng)傷性的檢查以及輔助檢測(cè)方法愈發(fā)受到關(guān)注［5，6］。其中，心肌細(xì)胞電生理相關(guān)指標(biāo)可以為表征心肌及心血管病變提供便捷無(wú)創(chuàng)的測(cè)量信息，相關(guān)研究則始于20 世紀(jì)50年代末。目前我們已經(jīng)明確急性心肌缺血以及左室肥厚等病理狀態(tài)下，可見(jiàn)跨壁復(fù)極離散度（TDR）增加［7］。心電圖Tp?Te 間期可以反映心室肌跨室壁復(fù)極離散度，而Tp?Te/QT 比值是校正后的Tp?Te 間期，排除心率影響后，這些指標(biāo)可以較為真實(shí)地反映TDR 狀態(tài)［8］。希望基于此類指標(biāo)檢測(cè)，可以為臨床醫(yī)師在CKD 心血管病變病程評(píng)估、療效判斷方面提供一種更為簡(jiǎn)便、可行、無(wú)創(chuàng)的輔助檢查方法。

1 對(duì)象與方法

1.1 構(gòu)建兔慢性腎衰竭模型對(duì)照組（5 只）：將食用油以10 mL/（kg·d）給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物定時(shí)、定量灌胃，全程正常飼養(yǎng)；每周內(nèi)眥靜脈采血1 mL 檢測(cè)血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清肌酐（serum cre?atinine，Scr）及C?反應(yīng)蛋白（C?reactive protein，CRP）；至第6 周造模結(jié)束時(shí)，行心臟超聲檢測(cè)。CKD 組（5 只）：將3%腺嘌呤食用油溶液以10 mL/（kg·d）給大鼠定時(shí)、定量灌胃，1 次/d，共6 周；每周內(nèi)眥靜脈采血1 mL 檢測(cè)BUN、Scr 及CRP，至第6周造模結(jié)束，余飼養(yǎng)同對(duì)照組；心臟超聲檢測(cè)、HM/BM 和LVM/BM、心肌組織學(xué)形態(tài)檢測(cè)同對(duì)照組。以Scr 水平進(jìn)行評(píng)估，Scr 水平均升高2～3 倍提示造模達(dá)標(biāo)。

1.2 觀察指標(biāo)及測(cè)量首先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心室肌細(xì)胞的分離與復(fù)鈣：制備膜片鉗的金屬電極為銀絲（鍍氯化銀），玻璃電極由硼酸鹽硬質(zhì)玻璃毛細(xì)管拉直而成（使用拉制儀多次拉制玻璃毛細(xì)管）；形成常規(guī)全細(xì)胞記錄模式，膜片鉗實(shí)驗(yàn)由計(jì)算機(jī)、Clampex軟件、數(shù)據(jù)采集卡和膜片鉗放大器組成。完成電極尖端與細(xì)胞膜之間的巨阻抗封接，形成全細(xì)胞記錄狀態(tài)。隨后進(jìn)行電生理學(xué)測(cè)定等。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.1 不同時(shí)期、不同部位心肌病理觀察 HE 染色后使用光鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)及病理改變。

1.2.2 心電圖測(cè)定 走紙速度為25 mm/s，電壓定標(biāo)：1 mV/cm，測(cè)量胸前各導(dǎo)聯(lián)的Tp?Te 間期取平均 值，測(cè) 定 胸 前 導(dǎo) 聯(lián)Tp?Te 離 散 度（Tp?Ted）。Tp?Te 間期為T 波頂點(diǎn)至T 波終點(diǎn)。Tp?Te 離散度為胸導(dǎo)聯(lián)最大Tp?Te 間期與最小間期之差。

1.2.3 借助單相動(dòng)作電位記錄技術(shù)分析心肌單相動(dòng)作電位 研究中將心室楔形肌塊以細(xì)針固定于灌注槽底硅膠板上行主動(dòng)脈逆行灌注，恒溫恒速下進(jìn)行灌注（37 ℃，5 mL/min），30 min 內(nèi)測(cè)定和對(duì)比心肌細(xì)胞的靜息膜電位（RMP）、最大動(dòng)作電位幅度（APA）和動(dòng)作電位復(fù)極90%時(shí)程（APD90）。

1.2.4 使用膜片鉗技術(shù)觀察電解質(zhì)干預(yù)下膜離子流變化 分析鉀離子和鎂離子對(duì)膜離子流的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用pClamp8.0 軟件進(jìn)行信號(hào)采集，Clampfit 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖形分析處理。計(jì)數(shù)和計(jì)量資料資料檢驗(yàn)分布特征后，使用對(duì)應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法完成組間對(duì)比的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)使用SPSS 軟件完成。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征及病理改變的觀察HE 染色后觀察心肌病理特征：光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組心肌纖維整體排列清晰整齊；心肌細(xì)胞呈短柱狀，結(jié)構(gòu)完整，染色較均勻，心肌纖維紋理清晰，排列整齊，粗、細(xì)心肌纖維相間。CKD 組心肌纖維排列尚清晰；心肌細(xì)胞分布彌散，結(jié)構(gòu)尚完整，染色欠均勻，細(xì)胞核可見(jiàn)破碎、溶解，核兩端肌漿分散，并可見(jiàn)周圍心肌細(xì)胞與之相溶，心肌纖維呈波浪狀且排列紊亂，局部肌纖維可見(jiàn)空泡變性以及出血。詳見(jiàn)圖1 所示。

圖1 兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌病理改變特征

2.2 T 波 振幅、Tp?Te、Tp?Ted 與CKD 病期的關(guān)系CKD 組T 波振幅總水平低于對(duì)照組水平；CKD組Tp?Te 以及Tp?Ted 總水平均高于對(duì)照組（均為P<0.05）。CKD 組內(nèi) 不同病期對(duì)比，1～4 期T 波振幅高于5 期水平，Tp?Te 以及Tp?Ted 均低于5 期水平（均P<0.05）。詳見(jiàn)表1 所示。

表1 波振幅、Tp?Te、Tp?Ted 與CKD 病期的關(guān)系特征分析

此外，對(duì)心肌細(xì)胞RMP、APA 和APD90分布及變化進(jìn)行分析，可見(jiàn)不同心肌細(xì)胞RMP、APA 和APD90基礎(chǔ)值差別未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表2 所示。隨著時(shí)間點(diǎn)變化，CKD 組及對(duì)照的外膜層心肌細(xì)胞RMP、APA 和APD90變化趨勢(shì)變化可見(jiàn)逐漸表現(xiàn)更低或先升高后減低的不同，詳見(jiàn)圖2 所示。

圖2 外膜層心肌細(xì)胞RMP、APA 和APD90變化趨勢(shì)對(duì)比

表2 心室M 細(xì)胞及外膜層心肌細(xì)胞RMP、APA 和APD90 基礎(chǔ)值分布特征

2.3 鉀離子、鎂離子的影響作用分析本研究中浸浴液K+濃度為75 mmol/L 和145 mmol/L，實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到鉀的平衡電位；當(dāng)膜電位高于此平衡電位后，電流可見(jiàn)轉(zhuǎn)成外向，但幅值很小；繼續(xù)增大膜電位后，電流幅值并不繼續(xù)增大。進(jìn)一步觀察，細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度對(duì)內(nèi)向整流作用的影響：在無(wú)Mg2+浸浴液的條件下，I?V 曲線呈一準(zhǔn)曲線，表明內(nèi)向整流作用不明顯。當(dāng)浸浴液含1 mmol/L Mg2+時(shí)，內(nèi)向電流無(wú)影響，而外向電流受到明顯抑制，從而出現(xiàn)明顯內(nèi)向整流特點(diǎn)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)移去細(xì)胞內(nèi)Mg2+時(shí)內(nèi)向整流特性幾乎完全消失。

3 討論

近10 余年來(lái)，慢性腎臟病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)迅速增長(zhǎng)，并已呈現(xiàn)流行趨勢(shì)，它不僅是原發(fā)性腎臟疾病，也可出現(xiàn)在高血壓、糖尿病等其他疾病的中、晚期階段［9］，我國(guó)有一線城市≥40歲人群的流行病學(xué)調(diào)查［10］顯示CKD 的發(fā)病率已達(dá)接近10%的水平。在CKD 患者中，由于神經(jīng)、體液、內(nèi)分泌、代謝等多方面的改變，可以出現(xiàn)包括心室收縮、舒張功能改變?cè)趦?nèi)的多種心臟受損的表現(xiàn)，或加重患者原有心臟病受損傷的程度。心力衰竭（heart failure，HF）也是常見(jiàn)的心臟損害表現(xiàn)，其不僅是許多心血管疾病發(fā)展的終末階段，也是心血管疾病患者的重要死亡原因之一［11?14］。

本研究中，我們對(duì)對(duì)照組及CKD 動(dòng)物模型進(jìn)行了觀察，光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組心肌纖維整體排列清晰整齊；心肌細(xì)胞呈短柱狀，結(jié)構(gòu)完整，染色較均勻，心肌纖維紋理清晰，排列整齊，粗、細(xì)心肌纖維相間。CKD 組心肌纖維排列尚清晰；心肌細(xì)胞分布彌散，結(jié)構(gòu)尚完整，染色欠均勻，細(xì)胞核可見(jiàn)破碎、溶解，核兩端肌漿分散，并可見(jiàn)周圍心肌細(xì)胞與之相溶，心肌纖維呈波浪狀且排列紊亂，局部肌纖維可見(jiàn)空泡變性以及出血。另外，行心電圖檢測(cè)可見(jiàn)CKD 組T 波振幅總水平低于對(duì)照組水平；CKD 組Tp?Te 以及Tp?Ted 總水平均高于對(duì)照組（均P<0.05）。CKD 組內(nèi)不同病期對(duì)比，1～4 期T 波振幅高于5 期水平，Tp?Te 以及Tp?Ted 均低于5 期水平（均P<0.05）。提示存在CKD（心肌缺血）時(shí)，Tp?Te 間期和Tp?Ted 增大，Tp?Te 間期和Tp?Ted可作為反映跨壁復(fù)極離散度的無(wú)創(chuàng)性指標(biāo)。

心室外膜、中層及內(nèi)膜層心肌細(xì)胞間存在電生理異質(zhì)性，而中層細(xì)胞具有APD 長(zhǎng)、復(fù)極延緩的特性，心室不同層細(xì)胞間存在跨室壁復(fù)極不均一性，這一差異成為在病理?xiàng)l件下觸發(fā)后除極及折返性心律失常的主要原因［15?17］。本研究發(fā)現(xiàn)不同心肌細(xì)胞RMP、APA 和APD90基礎(chǔ)值差別未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著時(shí)間點(diǎn)變化，CKD 組及對(duì)照組的外膜層心肌細(xì)胞RMP、APA 和APD90變化趨勢(shì)變化可見(jiàn)逐漸表現(xiàn)更低或先升高后減低的不同。本研究進(jìn)一步對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探索，浸浴液K+濃度為75 mmol/L 和145 mmol/L，實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到鉀的平衡電位；當(dāng)膜電位高于此平衡電位后，電流可見(jiàn)轉(zhuǎn)成外向，但幅值很?。焕^續(xù)增大膜電位后，電流幅值并不繼續(xù)增大。說(shuō)明該離子流為K+攜帶，成內(nèi)向整流，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。進(jìn)一步觀察到，細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度對(duì)內(nèi)向整流作用的影響：在無(wú)Mg2+浸浴液的條件下，I?V 曲線呈一準(zhǔn)曲線，表明內(nèi)向整流作用不明顯。當(dāng)浸浴液含1 mmol/L Mg2+時(shí)，內(nèi)向電流無(wú)影響，而外向電流受到明顯抑制，從而出現(xiàn)明顯內(nèi)向整流特點(diǎn)。內(nèi)向整流作用相關(guān)機(jī)制一方面與“門的電壓依賴性”去激活作用有關(guān)，另一方面與細(xì)胞內(nèi)鎂離子等對(duì)激活門的阻滯作用緊密關(guān)聯(lián)。IKATP敏感性鉀通道（IKATP）等鉀通道的內(nèi)向整流作用均表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度依賴性。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)移去細(xì)胞內(nèi)Mg2+時(shí)內(nèi)向整流特性幾乎完全消失。

綜上所述，CKD 兔心肌跨壁復(fù)極離散的變化對(duì)心電圖T 波的形態(tài)有重要影響；希望基于此可以為臨床醫(yī)師在CKD 心血管病變病程評(píng)估、療效判斷方面提供一種更為簡(jiǎn)便、可行、無(wú)創(chuàng)的輔助檢查方法。