王建平 周青山

武漢大學人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科 湖北 武漢 430060

高血壓主要表現為動脈血壓持續(xù)升高，是心肌梗死、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中、心力衰竭等多種疾病的獨立危險因素，其病程進展導致血管重構，引起心、腦、腎、視網膜等多臟器靶器官損傷［1，2］。高血壓誘導的血管重構病理生理學改變主要有：血管內膜和中層增厚，外膜纖維化，血管張力和硬度增加；內皮細胞功能異常，血管平滑肌細胞增殖和遷移，血管炎癥激活；細胞外基質穩(wěn)態(tài)失衡［3?5］。改善高血壓誘導的血管重構，可能為預防和治療高血壓及其并發(fā)癥提供理論基礎。

薯蕷皂苷是從中草藥植物中提取，具有抗腫瘤、抗炎、抗心肌肥厚、護腎、護肝等廣泛保護效應［6，7］。既往大量研究證實：薯蕷皂苷抑制多種惡性腫瘤細胞生長，緩解肝臟、腎臟和腦等組織器官缺血/再灌注損傷［8?10］。在心血管疾病方面，薯蕷皂苷可改善阿霉素導致的心臟毒性損傷，改善氧化應激誘導的心肌細胞凋亡［11］。而薯蕷皂苷在高血壓誘導的血管重構中是否有保護作用尚不清楚。本研究將通過動物實驗，闡明薯蕷皂苷在血管緊張素誘導的血管重構中作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物將40 只雄性C57BL/6 小鼠（清潔級，12 周齡左右）（購自湖北省實驗動物中心）分為4組：生理鹽水灌胃組（Saline 組）、薯蕷皂苷灌胃組（Dioscin 組）、血管緊張素Ⅱ泵注+生理鹽水灌胃組（AngⅡ+Saline 組）、血管緊張素Ⅱ泵注+薯蕷皂苷灌胃組（AngⅡ+Dioscin），每組10 只小鼠。生理鹽水或薯蕷皂苷［80 mg/（kg·d）］（購自美國Selleck 公司）連續(xù)灌胃7 d，再予以血管緊張素Ⅱ（購自美國Sigma 公司）［1 500 ng/（kg·d）］皮下泵注14 d。處死前，利用全自動大小鼠無創(chuàng)血壓測量儀（購自澳大利亞PowerLab 公司），測量小鼠清醒靜息狀態(tài)下尾動脈收縮壓（mmHg），取3 次有效測量數據取平均值。2%戊巴比妥鈉麻醉后處死小鼠，取胸主動脈、心臟、血漿、腎臟，液氮處理后，-80 ℃冰箱保存。

1.2 蘇木素?伊紅（HE）染色取小鼠胸主動脈后，4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟后包埋和切片。石蠟切片二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，透明。蘇木紫染色10 min，洗滌后鹽酸乙醇分化，自來水沖洗15 min，伊紅染色3 min。脫水、透明、中性樹脂封片，顯微鏡觀察胸主動脈大體形態(tài)。

1.3 Van Gieson 染色將石蠟切片脫蠟、水化，鐵蘇木紫染色10 min，洗滌后鹽酸乙醇分化。加入Van Gieson 染液染色5 min，95%乙醇分化，脫水、透明，封片。顯微鏡觀察胸主動脈彈力纖維狀態(tài)。

1.4 組織免疫組化將小鼠胸主動脈石蠟包埋組織切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，切片放入枸櫞酸?枸櫞酸鈉溶液（pH=7.4）微波爐加熱，進行抗原修復，PBS 洗3 遍；3% 過氧化氫溶液孵育10～15 min，阻斷組織內源性過氧化物，PBS 洗3 遍；5%山羊血清室溫封閉1 h，PBS 洗3 遍；加入相應一抗（PCNA，稀釋濃度1∶200；ICAM?1，稀釋濃度1∶150），4 ℃封閉過夜，PBS 洗3 遍；辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下孵育1 h，二氨基苯胺（DAB）避光顯色10 min。蘇木紫復染細胞核，乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，中性樹脂封片，普通顯微鏡拍攝，采用Image?pro Plus 軟件分析圖片，計算并統(tǒng)計PCNA 和ICAM?1 相對表達水平。

1.5 組織免疫熒光小鼠胸主動脈石蠟包埋組織切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，切片放入枸櫞酸?枸櫞酸鈉溶液（pH=7.4）微波爐加熱，進行抗原修復，PBS 洗3 遍；3%過氧化氫溶液孵育10～15 min，阻斷組織內源性過氧化物，PBS 洗3 遍；5%山羊血清室溫封閉1 h，PBS 洗3 遍；加入相應一抗（α?SMA，稀釋濃度1∶200；VCAM?1，稀釋濃度1∶150），4 ℃封閉過夜，PBS 洗3 遍；滴加藻紅蛋白（PE）標記的熒光二抗，室溫避光孵育1 h，PBS 洗3遍；二脒基?2?苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）復染細胞核，脫水、透明、封片，倒置熒光顯微鏡觀察，Image?pro Plus 軟件分析，計算并統(tǒng)計主動脈組織VCAM?1 和α?SMA 相對表達水平。

1.6 免疫印跡實驗全組織蛋白提取試劑盒提取組織蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，上樣后10%SDS?PAGE 膠電泳（80 V，0.5 h；110 V，1 h），將蛋白電泳轉膜至PVDF 膜，5% BSA 封閉2 h，TBST 洗膜3遍；相應一抗（稀釋濃度1∶1 000）4 ℃孵育過夜。TBST 洗3 次后，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1.5 h，TBST 洗3 遍，增強型化學發(fā)光試劑曝光，Tanon 全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)獲取蛋白條 帶，以GAPDH 為 內 參，Gel?Pro Analyzer 4.0 軟件分析目的條帶灰度值。

1.7 細胞實驗培養(yǎng)小鼠主動脈血管平滑肌細胞（MOVAS），細胞融合度達到50%，加入生理鹽水或薯蕷皂苷（200 ng/mL），孵育2 h。加入AngⅡ（1 μmol/L），繼續(xù)孵育24 h。提取細胞蛋白，進行Western Blot 檢測。

1.8 統(tǒng)計學分析采用Graphpad Prsim5.0 進行統(tǒng)計，數據以均值±標準誤表示，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 薯蕷皂苷緩解血管緊張素Ⅱ誘導的血管重構見圖1。血管緊張素Ⅱ皮下泵注2 周成功誘導小鼠高血壓形成。與saline 組相比，AngⅡ+Saline組小鼠血壓顯著升高［分別為（154±6.01）mmHg和（113.36±6.68）mmHg，P<0.05）］。薯蕷皂苷灌 胃 干 預 后，與Ang Ⅱ+Saline 組 相 比，Ang Ⅱ+Disocin 組小鼠血壓下降［分別為（136.02±8.9）mmHg 和（154±6.01）mmHg，P<0.05）］（圖1C）。形態(tài)學檢測發(fā)現：血管緊張素Ⅱ皮下泵注成功誘導血管重構，AngⅡ+Saline 組小鼠胸主動脈HE 染色可見血管中層增厚，EVG 染色可見部分彈力纖維斷裂（圖1A 和1B）。與AngⅡ+Saline 組相比，AngⅡ+Dioscin 組小鼠胸主動脈血管重構明顯緩解，血管中層厚度降低（P<0.05），彈力纖維走行規(guī)整，未見斷裂（圖1A 和1B）。

圖1 薯蕷皂苷緩解血管緊張素Ⅱ誘導的血管重構

2.2 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導的血管內皮細胞功能異常免疫組化和組織免疫熒光染色結果表明，與Saline 組相比，AngⅡ+Saline 組小鼠主動脈組織ICAM?1 和VCAM?1 表達上調（P<0.05）（圖2），這提示血管緊張素Ⅱ刺激后，血管內皮細胞功 能 異 常。與Ang Ⅱ+Saline 組 相 比，Ang Ⅱ+Dioscin 組小鼠主動脈組織ICAM?1 和VCAM?1 表達下調（P<0.05）（圖2）。

圖2 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導的血管內皮細胞功能異常

2.3 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞表型轉化通過免疫組化和組織免疫熒光實驗，我們發(fā)現：與Saline 組相比，AngⅡ+Saline 組小鼠主動脈組織α?SMA 表達水平顯著下降（P<0.05），PCNA 表達上調（P<0.05）。與AngⅡ+Sa?line 組相比，AngⅡ+Dioscin 組小鼠主動脈α?SMA表達上調（P<0.05），PCNA 表達下調（P<0.05）（圖3A）。Western Blot 結果顯示：與Saline 組相比，AngⅡ+saline 組小鼠主動脈發(fā)生顯著的血管平滑肌細胞表型轉化，收縮型標記分子α?SMA 和cal?ponin1 表達下調（P<0.05），合成型標記分子Vi?mentin 和PCNA 表達上調（P<0.05）。與AngⅡ+Saline 組相比，AngⅡ+Dioscin 組主動脈血管平滑肌細胞表型轉化緩解，α?SMA 和calponin1 表達水平上調（P<0.05）（圖3B、3C、3D），Vimentin 和PCNA表達水平下降（P<0.05）（圖3B、3E、3F）。

圖3 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞表型轉化

2.4 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導的血管炎癥通路激活Western Blot顯示：與Saline 組相比，AngⅡ+Saline 組小鼠主動脈組織磷酸化STAT1 和磷酸化IκBα 表達顯著上調（P<0.05），提示血管重構過程中炎癥通路激活。與AngⅡ+Saline 組相比，AngⅡ+Dioscin 組小鼠主動脈組織磷酸化STAT1 和磷酸化IκBα 表達下調（P<0.05）（圖4）。

圖4 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導的血管炎癥通路激活

2.5 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞表型轉化和炎癥通路激活 細胞實驗Western Blot 顯示：與Saline 組相比，AngⅡ+Saline組血管平滑肌細胞收縮型標記分子α?SMA 表達下調（P<0.05），合成型標記分子Vimentin 表達上調（P<0.05），提示血管緊張素誘導血管平滑肌細胞發(fā)生表型轉化；炎癥通路激活相關分子磷酸化STAT1 和磷酸化IκBα 表達顯著上調（P<0.05）。與AngⅡ+Saline 組 相 比，AngⅡ+Dioscin 組 小 鼠血管平滑肌細胞表型轉化緩解，磷酸化STAT1 和磷酸化IκBα 表達下調（P<0.05）（圖5）。

圖5 薯蕷皂苷抑制血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞表型轉化和炎癥通路激活

3 討論

高血壓是由基因、環(huán)境因素、神經?體液因子失衡、腎素?醛固酮系統(tǒng)過度激活、胰島素抵抗等眾多因素導致的全身阻力血管壓力持續(xù)升高（收縮壓≥140 mmHg 或舒張壓≥90 mmHg）。長期高血壓導致血管重構，血管重構主要病理生理學改變包括：血管內皮功能障礙，血管平滑肌細胞增殖、遷移和表型轉化增強，血管外膜纖維化，血管炎癥激活，膠原沉積，血管壁增厚，動脈硬化，收縮/舒張功能異常，引起血管功能和結構異常，最終導致血流動力學紊亂，心臟、腎臟、視網膜、腦等多臟器靶器官受損［4，12］?？刂蒲獕汉透纳蒲苤貥嬍歉哐獕杭跋鄳l(fā)癥治療的重要措施。

血管內皮細胞功能異常是血管重構發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。血管內皮細胞合成釋放多種細胞因子，參與血管張力維持、血管新生、炎癥反應、血管通透性等多種病理生理學效應的調節(jié)［13，14］。高血壓中，血管內皮細胞舒血管因子如內皮細胞來源超極化因子（EDH）、內皮源性一氧化氮等合成減少，縮血管因子如內皮素?1、血栓素A2 和超氧化物等釋放增加，血管持續(xù)收縮［15］。此外，高血壓發(fā)生發(fā)展過程中，血管內皮細胞氧化應激和炎癥反應激活，內皮細胞表面的細胞間黏附因子（血管細胞黏附分子?1、細胞間黏附分子?1、內皮細胞選擇素等）表達上調，內皮細胞分布和排列完整性破壞，血管通透性增加，易于炎癥細胞吸附、募集和遷移至血管壁［13，16］。薯蕷皂苷抑制TNF?α 誘導的血管內皮細胞VCAM?1、ICAM?1 和內皮脂肪酶的表達［17］。本研究發(fā)現，薯蕷皂苷干預可緩解血管緊張素Ⅱ誘導的主動脈組織VCAM?1 和ICAM?1 表達上調，改善內皮細胞功能。

血管平滑肌細胞表型轉化在血管重構中起重要作用。血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓發(fā)生發(fā)展過程中，血管平滑肌細胞增殖和遷移能力增強，同時發(fā)生顯著的表型轉化，由收縮表型向合成表型轉化，收縮表型標記分子α?SMA、calponin1、smoothe?lin 和desmin 等表達下調，合成表型標記分子Vimentin、OPN 和PCNA 等表達上調［4，18］。既往研究發(fā)現：薯蕷皂苷可通過抑制MAPK?FoxM1 通路，緩解頸動脈損傷后內膜增生［19］。我們動物實驗和細胞實驗研究發(fā)現：薯蕷皂苷可改善血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞表型轉化。

血管炎癥反應激活在血管重構中有著重要作用。血管重構中，血管內皮細胞功能異常，血管通透性增強，炎癥細胞吸附和遷移進入血管壁，刺激血管內皮細胞、血管平滑肌細胞和血管外膜成纖維細胞炎癥反應激活，釋放大量炎癥因子，進一步加重內皮損傷、血管平滑肌細胞增殖遷移和表型轉化、外膜纖維化、炎癥細胞浸潤等病理生理學改變［16，20］。大劑量血管緊張素Ⅱ干預甚至誘導動脈瘤/主動脈夾層形成［21］。既往研究發(fā)現：薯蕷皂苷抑制血管內皮細胞和巨噬細胞TNF?α、IL?1β 和IL?6 分泌；同時，薯蕷皂苷抑制TLR4 通路，降低NF?κB 轉錄活性，改善腦缺血再灌注損傷［7］。我們研究發(fā)現：薯蕷皂苷干預可降低血管緊張素Ⅱ誘導的主動脈組織磷酸化STAT1 和磷酸化IκBα 表達水平，緩解主動脈組織炎癥反應。薯蕷皂苷可能抑制血管內皮細胞炎癥反應，改善內皮功能，抑制炎癥細胞黏附；抑制血管平滑肌細胞炎癥反應，減少炎癥因子釋放，緩解血管平滑肌細胞表型轉化，維持血管彈性。薯蕷皂苷通過緩解血管內皮細胞和血管平滑肌細胞炎癥激活和改善平滑肌細胞表型轉化，改善血管緊張素Ⅱ誘導的血管重構。

綜上所述，本研究發(fā)現并初步證實薯蕷皂苷改善血管內皮功能，抑制血管平滑肌表型轉化和血管炎癥通路激活，改善血管緊張素Ⅱ誘導的血管重構，為高血壓及其并發(fā)癥防治提供新的理論依據。本研究不足之處在于，薯蕷皂苷抗血管重構具體靶點尚不清楚，需進一步研究。