唐月婷，孟 凱，2，張克勤，2，趙薈菁，2

［1.蘇州大學紡織與服裝工程學院，江蘇蘇州 215123；2.現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室（蘇州），江蘇蘇州 215123］

花青素（anthocyanins）是一種天然水溶性色素，存在于許多植物的果實和有色花瓣中，屬于黃酮類多酚化合物，同時也是植物花瓣上主要的呈色物質(zhì)。除了具有抗氧化、抗衰老等活性外［1］，花青素還可以在不同pH 的溶液中呈現(xiàn)不同的顏色［2］，在酸性條件下，水溶液呈紅色，溶液的主要成分為黃烊鹽離子；隨著pH 的增加，在中性條件下，花色苷在溶液中以無色的甲醇假堿存在；在堿性條件下，花色苷主要表現(xiàn)為藍色的醌式堿，溶液顏色變深。相比其他酸堿指示劑，花青素具有天然無毒、變色范圍廣的優(yōu)點，特別適合用于與人體相接觸的變色材料。王芳［3］和Roy等［4］將花青素與食品包裝材料結(jié)合制備智能指示膜，利用花青素的顏色變化指示食品新鮮度，但其顯色和穩(wěn)定性需要進一步提高，特別是熱穩(wěn)定性。

因為花青素活性很高，在加工、使用過程中，許多外界因素（如光、熱、氧氣等）都會影響花青素的穩(wěn)定性，從而限制了它的應(yīng)用范圍［5-8］。為提高花青素的穩(wěn)定性，有些學者用合適的材料包埋花青素制成微膠囊［9-12］，將花青素與外界環(huán)境隔離，能更有效地提高花青素的穩(wěn)定性。如陳程莉［9］以黑枸杞花青素為芯材，以糯米淀粉、改性糯米淀粉等5 種材料為壁材，采用噴霧干燥法制得微膠囊，考察了壁材對微膠囊穩(wěn)定性和緩釋性能的影響，并將其應(yīng)用于食品工業(yè)；單冠程等［12］用海藻酸鈉作壁材、黑米花青素為芯材，經(jīng)離子凝膠化，采用微膠囊包埋機通過雙噴頭包埋法制備黑米花青素微膠囊，并將其應(yīng)用于食品科技領(lǐng)域；李星宇［2］用海藻酸鈉、殼聚糖包埋花青素制備微膠囊，可以提高花青素的穩(wěn)定性，從而延長易氧化食品的保質(zhì)期。

微膠囊技術(shù)是提高生物活性化合物在溫度、光和氧氣等環(huán)境中穩(wěn)定性的有效手段。微膠囊具有核殼結(jié)構(gòu)，通常包括壁材和芯材兩部分［13-14］。微膠囊技術(shù)能隔離芯材與外部環(huán)境，有效地降低與外界環(huán)境因素的反應(yīng)，使芯材在穩(wěn)定的環(huán)境中存在，避免外界環(huán)境變化引起芯材損耗和反應(yīng)等諸多問題［15］。瞬時納米沉淀（FNP）法［16-17］是一種根據(jù)動力學控制原理，利用化學工程中的流體湍流混合制備微/納米材料的新型技術(shù)，可在極短的時間內(nèi)制備含有機活性物質(zhì)的聚合物納米粒子。FNP 法的技術(shù)特點是通過溶劑與非溶劑的快速混合，使溶解狀態(tài)的聚合物溶解度下降，從溶液中析出，并將芯材包覆形成微膠囊［18］。這種方法不僅具有粒徑易于調(diào)控、尺寸分布窄、制備時間短（毫秒級）、易于放大與連續(xù)化等特點，還可以系統(tǒng)地調(diào)控納米微觀結(jié)構(gòu)，如形貌、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、表面結(jié)構(gòu)等，為微/納米材料在紡織材料上的高效、低毒利用提供幫助［19］。

聚己內(nèi)酯（PCL）是一種生物可降解聚合物，對小分子有較高的滲透性，具有良好的生物相容性和無毒性，特別適用于制藥領(lǐng)域納米顆粒的生產(chǎn)和生物應(yīng)用［20］。因此，本研究以PCL 為壁材，將其溶于四氫呋喃（THF）中，以紫甘藍花青素（RCA）為芯材，將其溶于水中，采用FNP 法在密閉撞擊射流混合器（confined impingingjet mixers，CIJM）中制備微膠囊，將RCA 包埋在聚合物基質(zhì)中，減少與外界環(huán)境的接觸，以提高RCA 作為pH 變色指示劑的穩(wěn)定性。

1 實驗

1.1 材料和儀器

試劑：聚己內(nèi)酯［PCL，Mn=60 000～65 000 Da，阿拉丁試劑（上海）有限公司］，四氫呋喃（THF，純度大于等于99.5%，江蘇強盛功能化學股份有限公司），紫甘藍花青素（RCA，純度大于等于25%，西安雅圖生物科技有限公司），鹽酸、磷酸二氫鉀、氯化鉀（色譜純，國藥集團化學試劑蘇州有限公司），鄰苯二甲酸氫鉀（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司），氫氧化鈉（分析純，天津市大茂化學試劑廠），硼酸（99.8%，商丘市亮峰衛(wèi)生用品有限公司），去離子水。

儀器：LSP01-1B 型LSP 實驗室注射泵（保定迪創(chuàng)電子科技有限公司），HJ-4A 型多頭磁力攪拌器（江蘇科析儀器有限公司），AR224CN 型電子天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司］，密閉撞擊射流混合器（自制），PS-20A 型超聲波清洗器（深圳市臻潔康科技實業(yè)有限公司），H3-18KR 型臺式高速冷凍離心機（湖南可成儀器設(shè)備有限公司），LGJ-10 型真空冷凍干燥機（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司），PH818 型筆式pH檢測計（希瑪科技有限公司），S-4800 型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司），Nicolet 5700 iS5型傅里葉變換紅外光譜儀（美國熱電公司），Nano ZS90 型納米粒徑/電位分析儀（馬爾文儀器有限公司），Specord S600型紫外-可見分光光度計（德國耶拿分析儀器股份公司），SDT2960 型熱重/差熱聯(lián)用儀、DSC250 差示掃描量熱儀（美國TA 公司）。

1.2 制備方法

RCA溶液的配制：分別稱取0.25、0.50、0.75 g RCA加入到50 mL 去離子水中，攪拌至完全溶解，制得質(zhì)量濃度分別為5、10、15 mg/mL 的RCA 溶液。

PCL 溶液的配制：分別稱取0.25、0.50、0.75 g PCL加入到50 mL THF 中，攪拌至完全溶解，制得質(zhì)量濃度分別為5、10、15 mg/mL 的PCL 溶液。

FNP 法制備微膠囊的過程如圖1 所示。使用兩臺注射泵分別將RCA 溶液和PCL 溶液以相同的流速注入CIJM 的兩個入口（內(nèi)徑=1 mm），在注射泵的推動作用下，兩股流體以一定的流速在混合器中發(fā)生碰撞混合，溶有PCL 的有機溶劑在毫秒級的時間內(nèi)和水在CIJM 中快速混合，在極短的時間內(nèi)產(chǎn)生足夠高的過飽和度，產(chǎn)生固液相分離，使PCL 形成疏水的納米核心，新形成的成核種子捕獲溶解的分子（RCA）并生長形成微膠囊［21］。碰撞混合后的溶液從混合器的出口（內(nèi)徑=2 mm）流到裝有去離子水的燒杯中，形成微膠囊懸浮液，輕輕攪拌2 min以避免顆粒聚集。

將微膠囊懸浮液用孔徑為0.1 μm 的濾膜過濾，并加去離子水清洗，重復(fù)3 次，然后在-50 ℃下冷凍過夜，在溫度低于-50 ℃和真空度低于20 Pa 的條件下冷凍干燥48 h（確保完全去除水分），得到微膠囊粉末。制備樣品及工藝參數(shù)如表1所示。

表1 樣品及工藝參數(shù)

1.3 測試

1.3.1 微觀形貌與結(jié)構(gòu)

微觀形貌：采用掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）觀察PCL/RCA 微膠囊的形貌。

掃描電鏡：將微膠囊溶液過濾清洗后超聲處理5 min，滴在載玻片上，在室溫下干燥，噴金90 s 后，在5 kV 能量下采用掃描電子顯微鏡觀察微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)形貌。

透射電鏡：將微膠囊溶液過濾清洗后超聲處理5 min，轉(zhuǎn)移到300 目碳支持膜銅網(wǎng)上，紅外干燥后，在120 kV 能量下對微膠囊進行透射電鏡觀察。

1.3.2 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）

為分析微膠囊中的成分，用傅里葉變換紅外光譜儀對純RCA、純PCL 和PCL/RCA 微膠囊粉末分別進行測試。以溴化鉀壓片法制備試樣，掃描范圍為400～3 500 cm-1，分辨率為0.5 cm-1。

1.3.3 包封率及加載率

標準曲線繪制：配制不同質(zhì)量濃度的RCA 溶液進行紫外全譜掃描，已知花青素的兩個最大吸收波長，一個位于465～550 nm 的可見光范圍內(nèi)，另一個位于270～280 nm 的紫外光范圍內(nèi)［22］，設(shè)置掃描波長在400～600 nm，找到其可見光范圍內(nèi)的最大吸收波長，并在最大吸收波長下測定不同質(zhì)量濃度RCA 溶液的吸光度，繪制吸光度對質(zhì)量濃度的標準曲線，計算線性相關(guān)系數(shù)。

測量微膠囊懸浮液超速離心后上清液中的游離RCA質(zhì)量濃度，間接估算微膠囊的包封率（encapsulation efficiency，EE）。通常認為包封率越高越好，包封率越高證明壁材能更多更好地包埋住花青素，阻隔了外界環(huán)境因素對花青素的影響［9］。將微膠囊溶液在室溫下離心，以9 000 r/min 離心1 h，用紫外-可見分光光度計在最大吸收波長處測定上清液中RCA 的質(zhì)量濃度，計算出包封率。

微膠囊的包封率與加載率（loading capacity，LC）計算公式如下所示：

1.3.4 粒徑及其分布

微膠囊粒徑一般難以用肉眼觀察。用馬爾文粒度儀測定PCL/RCA 微膠囊原液的平均粒徑及粒徑分布，重復(fù)測量3次取平均值。

1.3.5 pH 變色響應(yīng)性實驗

1.3.5.1 配制pH 緩沖溶液

根據(jù)GB/T 4015—2008《化學試劑 酸堿指示劑pH 變色域測定通用方法》配制得到pH 為3～10 的緩沖溶液，然后觀察PCL/RCA 微膠囊在緩沖溶液中的pH 變色響應(yīng)性。pH 為3～10 緩沖溶液的具體配制方法見表2。

表2 pH 為3～10緩沖溶液的配制方法

1.3.5.2 顏色量化方法

HSV（hue，saturation，value）顏色空間基于顏色的直觀特性，H表示色相，S表示飽和度，V表示明度［23］。色相環(huán)如圖2 所示，色相H值中，0°或360°為紅色，60°為黃色，120°為綠色，180°為青色，240°為藍色，300°為品紅色。HSV 對于用戶來說是一種很直觀的顏色模型，在計算機視覺、遙感圖像處理識別等領(lǐng)域相對RGB 顏色模型具有獨特優(yōu)勢［24］。但人眼的色彩感知和RGB 顏色空間之間有很大差別，與HSV 顏色空間比較接近，HSV 模式在視覺上能更好地體現(xiàn)色彩與亮度的差異。該方法在圖像處理中具有獨特優(yōu)勢：（1）亮度與色度是區(qū)分開來的，亮度分量和圖像色彩信息不相關(guān)；（2）色調(diào)和飽和度相互獨立，并且與人類感知密切相關(guān)［25］。根據(jù)人眼視覺特性，在圖像分析中優(yōu)先選擇HSV 顏色空間進行色彩分析。

通過ON COLOR 顏色探測器對圖像的顏色信息進行數(shù)字化處理，對圖像進行顏色信息量化。拍照環(huán)境為室內(nèi)自然光源，拍攝鏡頭垂直于地面，使用智能手機（分辨率16 MP）采集圖像，每組溶液連續(xù)拍攝3張相片，計算3張相片的H分量平均值。

與傳統(tǒng)的目視比色法相比，數(shù)字圖像比色法不僅可以利用圖像分析方法識別和提取pH 指示材料的色彩信息，還能識別出小的顏色變化，避免了視覺觀測方法主觀性因素的影響，實現(xiàn)了色彩信息量化，提高了檢測準確度，實現(xiàn)了快速檢測且可對顏色變化進行定量分析，大大提高了顏色變化識別的準確性。

1.3.6 統(tǒng)計學方法

每組數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次并計算平均值，使用Origin對數(shù)據(jù)進行繪圖處理，運用SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進行正交實驗分析和ANOVA 差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 微觀形貌與結(jié)構(gòu)

以5 mg/mL PCL 溶液和10 mg/mL RCA 溶液制得的微膠囊為例，微膠囊表觀形貌如圖3 所示。由圖3a、3b 可知，PCL/RCA 微膠囊是較規(guī)整的球形結(jié)構(gòu)，表面無孔洞和裂紋，部分微膠囊的表面有不規(guī)則的凹陷和褶皺，這是干燥過程中微膠囊表面水分蒸發(fā)造成的，或在噴金過程中高真空所導(dǎo)致。

為了分析花青素在微膠囊中的分布情況，通過透射電鏡對微膠囊進行了觀察，結(jié)果如圖3c 所示。由圖3c 可以看出，透射電鏡顯示得到的微膠囊內(nèi)部有大塊黑色被包裹物質(zhì)；通過電子穿透樣品成像，紅色箭頭指向處可明顯看到其外層包覆有一層壁材。這證明PCL 與RCA 形成了微膠囊核殼結(jié)構(gòu)。

2.2 FTIR

傅里葉變換紅外光譜圖中同時出現(xiàn)囊芯和囊壁的特征吸收峰，可以用來確定芯材和壁材的存在［26］。用紅外光譜儀對純PCL、純RCA 和包裹花青素的微膠囊粉末進行掃描測試，結(jié)果如圖4所示。

由圖4a、4b 可以看出，在1 730 cm-1處的羰基（C—O）伸縮振動、2 950 和2 870 cm-1處飽和碳（—CH2—）上的C—H 伸縮振動、1 470～1 350 cm-1處的C—H面內(nèi)彎曲振動、1 250～1 140 cm-1處的C—O—C 伸縮振動、3 340 cm-1處的O—H 伸縮振動、800 cm-1處的O—H 彎曲振動吸收峰非常吻合。PCL/RCA 微膠囊的紅外光譜圖與純PCL 的圖譜一致，說明微膠囊中存在聚己內(nèi)酯，證實了外殼材料是聚己內(nèi)酯。

花青素主要由苯環(huán)、含氧雜環(huán)、羥基等部分組成［27］。由圖4a、4c 可以看出，在3 280 cm-1處的酚羥基O—H 振動、2 930 cm-1處的C—H 伸縮振動、1 650 cm-1處的苯環(huán)（C— C）伸縮振動、1 025 cm-1處的C—H面內(nèi)彎曲振動非常吻合，說明微膠囊中存在花青素。PCL 包埋RCA 后，沒有出現(xiàn)明顯的譜峰位移，說明兩種物質(zhì)沒有發(fā)生基團反應(yīng)。結(jié)合電鏡分析可確定，芯材RCA 被成功包覆在PCL 殼中。

2.3 包封率及加載率

2.3.1 標準曲線繪制

由圖5 可以看出，紫甘藍花青素最大吸收波長為535 nm。

根據(jù)不同質(zhì)量濃度紫甘藍花青素水溶液的紫外吸光度數(shù)據(jù)進行繪圖和線性擬合，結(jié)果如圖6所示。應(yīng)用數(shù)學擬合方法，得到花青素的標準曲線關(guān)系式為：

式中，x為RCA 的質(zhì)量濃度（mg/mL），y為RCA 的吸光度。在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，RCA 質(zhì)量濃度與紫外吸光度線性關(guān)系良好。

2.3.2 包封率及加載率測試結(jié)果

由表3 可以看出，微膠囊的包封率和加載率受注射泵進料流速和進料質(zhì)量濃度的影響，注射泵進料流速和RCA 質(zhì)量濃度越大，包封率和加載率越大；聚己內(nèi)酯質(zhì)量濃度越大，加載率越小，對包封率無明顯影響。

表3 微膠囊包封率及加載率測試結(jié)果

2.4 粒徑及其分布的影響因素

2.4.1 進料流速

圖7 顯示了微膠囊平均粒徑隨注射泵進料流速的變化趨勢。

由圖7 可看出，隨著進料流速從20 mL/min 增大到60 mL/min，微膠囊平均粒徑逐漸減小，粒徑分布更加集中。這可以用沉淀特征時間尺度來解釋：當進料流速增加時，特征混合時間減少，成核優(yōu)于生長，粒子越來越小。在較高的注射泵進料流速下，聚己內(nèi)酯的過飽和度較大，會形成更多的疏水核心，導(dǎo)致得到的微膠囊粒徑更?。徊⑶以诟叩牧魉傧?，液體混合得更加均勻，較高流速下混合液體在混合腔中停留的時間較短，微膠囊的生長時間也相應(yīng)減?。?8］。

2.4.2 花青素質(zhì)量濃度

圖8 給出了不同質(zhì)量濃度花青素溶液制備的微膠囊平均粒徑及其分布圖。由圖8 可以看出，微膠囊的粒徑都呈單峰正態(tài)分布，隨著花青素質(zhì)量濃度的降低，微膠囊平均粒徑逐漸減小，且粒徑分布更集中。這是RCA 有效摻入聚合物體系的結(jié)果。在微膠囊生產(chǎn)過程中，始終可以獲得較高的包封率，使得活性物質(zhì)的損耗少。初始RCA 質(zhì)量濃度較低的樣本，包封率最低。原因是隨著花青素質(zhì)量濃度的降低，RCA 能被聚合物有效包裹的量減少，從而粒徑更小。

2.4.3 聚己內(nèi)酯質(zhì)量濃度

圖9 給出了不同質(zhì)量濃度PCL 溶液制備的微膠囊平均粒徑及其分布圖。由圖9 可以看出，隨著PCL質(zhì)量濃度的增大，微膠囊的平均粒徑增大，粒徑分布范圍變大，而包封率無明顯變化。原因可能是隨著PCL 質(zhì)量濃度的增大，微膠囊在生長階段能獲得更多的聚合物，粒徑更大，最終得到微米大小的顆粒。

2.5 pH 變色響應(yīng)性

2.5.1 純花青素顯色

取少量RCA 粉末，滴加pH 為3～10 的緩沖溶液，RCA在不同pH下的顏色如表4所示，并用ON COLOR軟件識別H值。

表4 紫甘藍花青素顏色與H 值隨pH 的變化

由表4 可以看出，隨著酸堿度從酸性變?yōu)閴A性，RCA 顏色變化顯著，pH 為3～4 時，RCA 顯紅色；pH 為5～6 時為紫紅色；pH 為7 時顯示紫色；pH 為8～9 時顯示藍色；pH 為10 時呈現(xiàn)綠色。采集得到的原始影像數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后得到每組相片的H值，結(jié)果見表4。

2.5.2 微膠囊顯色

取少量微膠囊粉末（樣品5）置于濾紙上，分別滴加pH 為3～10 的緩沖溶液，PCL/RCA 微膠囊在不同pH 下的顏色如圖10 所示。由圖10 可以看出，PCL/RCA 微膠囊在不同pH 下具有明顯不同的顏色，隨著pH 的增加，微膠囊相應(yīng)產(chǎn)生3 個不同的顏色。其中，當pH 小于5 時，微膠囊呈紅色；當pH 為5～9 時，微膠囊由紅色向紫色轉(zhuǎn)變；當pH 大于9 時，微膠囊顏色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色，顯色結(jié)果與花青素趨勢一致。

由表5 可以看出，在pH 為3～10 時，微膠囊色相H值隨著緩沖溶液pH 的增加，從340°（紅色）左右逐漸降低到225°（藍色）左右，顏色由紅色逐漸變?yōu)樗{色。根據(jù)H值數(shù)值的變化可以判斷，雖然微膠囊顯色后H值與花青素不完全一致，但數(shù)值接近且變色趨勢相同，H值都隨pH 的增大而減小，顏色由紅色向藍色轉(zhuǎn)變，可以作為酸堿指示微膠囊應(yīng)用。

表5 pH 變色微膠囊在pH 為3～10時的H 值分量

3 結(jié)論

采用瞬時納米沉淀法制備了一種聚己內(nèi)酯（PCL）/花青素（RCA）微膠囊。所制備的微膠囊形態(tài)為球形，表面光滑完整，沒有裂縫和孔隙，能對芯材RCA 起到有效的包埋。微膠囊粒徑大小與RCA、PCL質(zhì)量濃度成正相關(guān)，與注射泵進料流速成負相關(guān)。微膠囊的包封率與注射泵進料流速和RCA 質(zhì)量濃度成正相關(guān)，PCL 質(zhì)量濃度對花青素包封率影響較小。微膠囊樣品在pH 為3～10 時可從紅到紫到藍連續(xù)變色，顯示其在傷口酸堿度監(jiān)測醫(yī)用敷料領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值。