祁大勇 劉 軍 趙志煌 李 剛 韓永剛

(1 河北省唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)外科，河北省唐山市 063000； 2 河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，河北省邯鄲市 056000； 3 河北省滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河北省滄州市 061000)

腦膠質(zhì)瘤是臨床常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，其在顱內(nèi)惡性腫瘤中的占比超過80%，年發(fā)病率約為0.06‰，且隨年齡的增長發(fā)病率逐漸升高，具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差等特征[1]。近年來，隨著手術(shù)切除方案及放化療方案的不斷優(yōu)化，腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后有所改善；但血腦屏障會限制化療藥物的效果，加之腦膠質(zhì)瘤的侵襲性高，患者的臨床治療效果受到明顯影響，其中高度惡性腦膠質(zhì)瘤患者的中位生存期仍不到15個月[2]。青藤堿是中藥青風(fēng)藤的主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、降壓、增強(qiáng)胃腸道興奮性、抗炎等藥理作用[3]。有研究表明，青藤堿可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，具有抗腫瘤活性[4]。然而，目前關(guān)于將青藤堿用于腦膠質(zhì)瘤治療的研究尚少，且缺乏對應(yīng)的機(jī)制研究。本研究通過建立腦膠質(zhì)瘤原位荷瘤小鼠模型，研究青藤堿對腦膠質(zhì)瘤血管生成的抑制作用，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞株 無特定病原體級BALB/c裸鼠45只，雄性，6周齡，體重(19±2)g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可SCXK(滬)2017-0010]。大鼠購入后飼養(yǎng)于清潔、通風(fēng)環(huán)境，溫度為(23±2) ℃，濕度為(60±5)%，明暗周期12 h/12 h循環(huán)。人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87-MG細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物、主要試劑、儀器 青藤堿(純度>98%)購自上海禾午生物科技有限公司(批號：6080-33-7)。LipofectamineTM3000試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司(批號：L3000001)，腫瘤易感候選基因11(cancer susceptibility candidate 11,CASC11) mimics質(zhì)粒購自上海銳賽生物技術(shù)有限公司，TRIzol試劑購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司(批號：LM-0010)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司(批號：R2043)，實(shí)時熒光定量PCR SYBR Ⅱ試劑盒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司(批號：QPG-020)，免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司(批號：E670033-0100)，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自上海睿時生物科技有限公司(批號：23225)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自武漢艾美捷科技有限公司(批號：A21010)， GAPDH、兔抗小鼠CD31、絲氨酸/蘇氨酸激酶3(serine/threonine kinase 3，AKT3)一抗購自美國Abcam公司(批號：Ab9485、ab28364、ab32505)。StepOnePulsTM實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，BX41顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社，Gel Doc EZ凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87-MG細(xì)胞置于含有10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗的DMEM中，37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至貼壁，胰酶消化傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，使用PBS進(jìn)行洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL，接種至6孔板，2 mL/孔，待細(xì)胞融合至貼壁，按照LipofectamineTM3000試劑盒說明書操作，將CASC11過表達(dá)質(zhì)粒CASC11 mimics轉(zhuǎn)染至U87-MG細(xì)胞，6 h后更換為不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另取U87-MG細(xì)胞按照上述步驟進(jìn)行培養(yǎng)，但不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CASC11 mRNA的表達(dá)情況 取未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染48 h后的U87-MG細(xì)胞，使用PBS洗滌后，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參檢測CASC11 mRNA的表達(dá)水平。配制反應(yīng)體系：雙倍核酸染料10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板cDNA 2 μL，雙蒸水補(bǔ)足至總體積為20 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性40 s；95 ℃變性8 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，重復(fù)40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)所用引物：CASC11上游引物為5′-GCTGCAGAAGGTCCGAAGAA-3′，下游引物為5′-TTCACCACGTCCAGTTGCTT-3′；GAPDH上引物游為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。采用2-△△Ct法計算各待測基因的相對表達(dá)量。設(shè)置5個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 建立腦膠質(zhì)瘤原位荷瘤裸鼠模型 參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行建模。取全部BALB/c裸鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取10只設(shè)為空白組，右腋皮下注射生理鹽水0.1 mL。其余35只建立腦膠質(zhì)瘤原位荷瘤模型，隨機(jī)選取25只裸鼠，給予右腋皮下注射未轉(zhuǎn)染的U87-MG細(xì)胞懸液0.1 mL(細(xì)胞密度為1×108個/mL)，以瘤體積100 mm3左右為建模成功標(biāo)準(zhǔn)，建模成功20只，剔除不合格裸鼠5只，再采用隨機(jī)數(shù)字表法將這20只裸鼠分為腦膠質(zhì)瘤組、青藤堿組各10只。給予剩余10只裸鼠右腋皮下注射轉(zhuǎn)染48 h后的U87-MG細(xì)胞懸液0.1 mL(細(xì)胞密度為1×108個/mL)，設(shè)為mimics聯(lián)合青藤堿組，均建模成功。

1.6 干預(yù)方式 參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行干預(yù)。建模后7 d，給予青藤堿組、mimics聯(lián)合青藤堿組裸鼠腹腔注射青藤堿生理鹽水溶液(經(jīng)生理鹽水稀釋后濃度為1.2 mg/mL)20 mg/kg，空白組、腦膠質(zhì)瘤組腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，持續(xù)14 d。

1.7 組織取材及抑瘤率和脾臟指數(shù)的測定 干預(yù)結(jié)束后次日，稱取裸鼠重量，通過腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉裸鼠后將其脫頸處死，迅速剝離腫瘤塊，稱取其重量，計算抑瘤率，抑瘤率=(腦膠質(zhì)瘤組腫瘤重量-干預(yù)組腫瘤重量)/腦膠質(zhì)瘤組腫瘤重量×100%。取部分腦膠質(zhì)瘤組織分成兩份，一份置于預(yù)冷的40%中性甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，使用切片機(jī)將其切為厚度4 μm的連續(xù)切片，用于免疫組織化學(xué)染色；另一份置于液氮中保存，用于蛋白檢測。開腹分離出脾臟，生理鹽水沖去殘留血液后，用濾紙吸干水分并稱重，計算脾臟指數(shù)，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.8 免疫組織化學(xué)染色法檢測微血管密度 取膠質(zhì)瘤組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、PBS洗滌后，加入3%過氧化氫溶液浸泡10 min，然后加入抗原修復(fù)液1 mL，微波抗原修復(fù)，冷卻至室溫，蒸餾水漂洗，滴加5%胎牛血清5 mL封閉孵育20 min，棄去血清，加入兔抗人CD31一抗(1 ∶500)2 mL，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌2次，加入二抗(1 ∶2 000)1 mL，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌2次。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，封片劑封片，隨機(jī)選取5個不重復(fù)視野，以棕黃色單個內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞群作為一個血管，記錄每個視野的血管數(shù)量，計算5個視野的均值，以每個視野平均血管數(shù)量表示血管密度。

1.9 Western blot檢測腫瘤組織AKT3蛋白的表達(dá)量 取在液氮中保存的膠質(zhì)瘤組織，用眼科剪剪碎后，于研磨器中研磨，加入RIPA裂解液2 mL，轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃ 10 000 r/min離心8 min(離心半徑12 cm)，取其上清，采用二喹啉甲酸法測定總蛋白并定量。取50 g待測蛋白，加入5倍體積上樣緩沖液混勻，水浴加熱沸騰5 min，相同條件下離心取上清，恒定電壓下行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉2 h，混合兔抗小鼠AKT3一抗(1 ∶5 000)、GAPDH一抗(濃度1 ∶500)各1 μL，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜，與1 μL二抗(1 ∶2 000)混合，室溫孵育1 h，TBST洗膜，發(fā)光液顯色，暗室曝光，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，AKT3蛋白相對表達(dá)量=AKT3條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CASC11 mRNA的表達(dá)量的比較 未轉(zhuǎn)染U87-MG細(xì)胞、轉(zhuǎn)染48 h后U87-MG細(xì)胞中CASC11 mRNA的表達(dá)量分別為(0.21±0.03)、(0.98±0.12)，轉(zhuǎn)染24 h后U87-MG細(xì)胞的CASC11表達(dá)量高于未轉(zhuǎn)染U87-MG的細(xì)胞(t=13.920，P<0.001)，提示轉(zhuǎn)染成功。

2.2 青藤堿組和mimics聯(lián)合青藤堿組抑瘤率的比較 mimics聯(lián)合青藤堿組、青藤堿組的抑瘤率分別為(30.29±4.46)%、(52.10±6.87)%，前者低于后者(t=8.420，P<0.001)。

2.3 4組裸鼠脾臟指數(shù)的比較 與空白組比較，腦膠質(zhì)瘤組的脾臟指數(shù)降低(P<0.05)；與腦膠質(zhì)瘤組比較，青藤堿組的脾臟指數(shù)升高(P<0.05)；與青藤堿組比較，mimics聯(lián)合青藤堿組的脾臟指數(shù)降低(P<0.05)。見表1。

2.4 4組裸鼠腫瘤微血管密度的比較 與腦膠質(zhì)瘤組比較，青藤堿組的微血管密度降低(P<0.05)；與青藤堿組比較，mimics聯(lián)合青藤堿組的微血管密度升高(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 4組裸鼠脾臟指數(shù)和腫瘤微血管密度的比較(x±s)

圖1 各組荷瘤裸鼠腫瘤微血管生成情況(免疫組織化學(xué)染色，×400，標(biāo)尺25 μm)

2.5 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織AKT3蛋白表達(dá)量的比較 與腦膠質(zhì)瘤組比較，青藤堿組AKT3蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05)；與青藤堿組比較，mimics聯(lián)合青藤堿組AKT3蛋白的表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖2和表2。

圖2 Western blot檢測腫瘤組織AKT3蛋白表達(dá)量

表2 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織AKT3蛋白的相對表達(dá)量(x±s)

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)外胚葉組織的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，其深入腦組織呈浸潤性生長，與正常組織無明顯分界點(diǎn)[7]。腦膠質(zhì)瘤的臨床表現(xiàn)為顱內(nèi)壓增高、視力下降、頭痛、嘔吐，部分患者出現(xiàn)癲癇癥狀[8]。目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多認(rèn)為與基因突變、細(xì)胞信號通路改變等有關(guān)[9]。腦膠質(zhì)瘤的浸潤生長與內(nèi)部大量新生血管的生成密切相關(guān)，是腦膠質(zhì)瘤發(fā)展及復(fù)發(fā)的主要原因之一，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞可分泌大量血管內(nèi)皮生長因子，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，加快血管生成[10]。因此，尋找有效抑制腫瘤血管生成的藥物或手段，對于改善患者預(yù)后、降低病死率與復(fù)發(fā)率具有重要意義。

中醫(yī)認(rèn)為腦膠質(zhì)瘤屬于“積癥”“眩暈”“癲狂”范疇，是風(fēng)、火、痰、瘀、濕多種病理因素共同作用的結(jié)果，其主要病機(jī)為外感風(fēng)毒、肝腎不足、正氣虛弱，以致風(fēng)痰瘀血于腦絡(luò)、積毒腦內(nèi)、腫大成塊終而發(fā)病，故治療上應(yīng)以祛風(fēng)扶正為主[11]。中醫(yī)青風(fēng)藤取自防己科植物青藤的干燥藤莖，性平，味苦、辛，歸肝經(jīng)、脾經(jīng)，可除濕、祛風(fēng)、行氣、利水。《浙江天目山藥植志》記載，青風(fēng)藤可治風(fēng)水腫、腳氣、風(fēng)濕、關(guān)節(jié)疼痛、口眼歪斜，癰腫惡瘡[12]。青藤堿是一種活性生物堿，Ik等[13]在觀察其對慢性哮喘小鼠的治療作用時發(fā)現(xiàn)，青藤堿可抑制血管生成，并調(diào)節(jié)Th2相關(guān)免疫反應(yīng)。脾臟是機(jī)體重要的外周免疫器官，是免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要部位，脾臟指數(shù)可反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)[14]。血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31參與腫瘤細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過程，是一種穩(wěn)定性較高的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，可作為惡性腫瘤免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的常規(guī)指標(biāo)[15]。因此本研究選取脾臟指數(shù)和基于CD31標(biāo)記的微血管密度作為觀察指標(biāo)。結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組的脾臟指數(shù)較空白組降低(P<0.05)，提示膠質(zhì)瘤原位荷瘤裸鼠的免疫功能降低；而給予青藤堿干預(yù)后，膠質(zhì)瘤原位荷瘤小鼠的抑瘤率為(52.10±6.87)%，且脾臟指數(shù)升高、微血管密度降低(均P<0.05)，提示青藤堿可提升腦膠質(zhì)瘤裸鼠的免疫功能、抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長，具有一定的抗腦膠質(zhì)瘤作用。

CASC11是一種長鏈非編碼RNA，其作為一種致癌基因高表達(dá)于多種惡性腫瘤，參與調(diào)節(jié)多個細(xì)胞通路，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，常作為惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)及預(yù)后評估的標(biāo)志物[16]。AKT3是AKT家族亞型之一，作為磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的下游效應(yīng)因子，可被PI3K1活化，活化后的AKT3可磷酸化AKT殘基的底物，間接激活其下游蛋白因子，從而與其共同作用參與腫瘤組織血管生成的調(diào)節(jié)[17]。Ma等[18]研究認(rèn)為，過表達(dá)AKT3可促進(jìn)癌細(xì)胞生長，消除G0/G1期的細(xì)胞周期停滯，增強(qiáng)其增殖及遷移能力，從而促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)展，提示AKT3可促進(jìn)惡性腫瘤生長。本研究結(jié)果顯示，與青藤堿組比較，mimics聯(lián)合青藤堿組的抑瘤率、脾臟指數(shù)降低，微血管密度升高，提示過表達(dá)CASC11可削弱青藤堿抑制腦膠質(zhì)瘤血管生成及腫瘤生長、改善免疫功能的作用。此外，青藤堿組AKT3蛋白的表達(dá)量低于腦膠質(zhì)瘤組，而mimics聯(lián)合青藤堿組AKT3蛋白的表達(dá)量反而高于青藤堿組(P<0.05)。這提示青藤堿可能通過抑制CASC11的表達(dá)來下調(diào)AKT3蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮其抑瘤作用。

綜上所述，青藤堿可提升腦膠質(zhì)瘤原位荷瘤裸鼠的免疫功能，抑制腫瘤血管生成，其可能通過抑制CASC11表達(dá)進(jìn)而下調(diào)AKT3蛋白表達(dá)來發(fā)揮作用。然而，本研究存在一定不足，如僅檢測了正常裸鼠的脾臟指數(shù)進(jìn)行比較，未取正常裸鼠腦組織檢測微血管密度及AKT3蛋白表達(dá)量，今后將進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計以驗(yàn)證所得結(jié)論。