孫于寒 彭浩 寧靜 劉紫嫣 蘭阿峰

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000)

羊肚菌(Morchella)在分類學(xué)角度上，可歸屬于真核真菌界子囊菌門子囊菌亞門盤菌綱盤菌目羊肚菌科羊肚菌屬，是世界4大名菌之一[1]，我國明朝李時(shí)珍所著《本草綱目》中有其記載。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，羊肚菌是一種珍稀的食藥用真菌，具有壯陽、補(bǔ)腎﹑提神﹑化痰理氣的功效[2-5]。還有研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌具有抗氧化、抗炎消菌、抗疲勞、抑制腫瘤、抑制癌癥、降低機(jī)體血脂、提高機(jī)體免疫力以及保肝保臟保血脂等功效。研究表明，這些功效均源于羊肚菌中富含的多種生物活性物質(zhì)，如多糖、多酚、酶類，以及甾醇、亮氨酸、呋喃化合物等。但目前對羊肚菌生物活性物質(zhì)研究主要集中于羊肚菌多糖的發(fā)酵條件優(yōu)化及其抗氧化、抗腫瘤方面，而有關(guān)羊肚菌黃酮的研究利用較少[6]。

研究表明，黃酮類提取物是一種天然的強(qiáng)抗氧化劑，其可以將活躍但對機(jī)體有害的自由基氧化還原成為一種特別穩(wěn)定且相對無害的物質(zhì)，從而達(dá)到有效清除機(jī)體體內(nèi)氧自由基的結(jié)果。大量研究表明，食用菌黃酮類化合物具有普遍的抗氧化活性[7-10]。鄭少杰研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌中的游離酚提取物對細(xì)胞有一定的抗氧化作用，并且能夠相對有效的減少Caco-2細(xì)胞及HepG2細(xì)胞的增殖與擴(kuò)散[11]。

羊肚菌黃酮類物質(zhì)存在于羊肚菌子實(shí)體、菌絲體和發(fā)酵液中，可分為子實(shí)體黃酮、菌絲體胞內(nèi)黃酮和胞外黃酮[12]。本研究通過液體發(fā)酵培養(yǎng)，比較7株羊肚菌菌株的胞外黃酮含量，從中篩選出羊肚菌胞外黃酮產(chǎn)量較高的菌株，并對羊肚菌黃酮類化合物在抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗菌、抗過敏等作用的研究提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

羊肚菌菌株(Y-1～Y-7)由陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院微生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 菌種活化培養(yǎng)基

馬玲薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41.0g·L-1，MgSO40.5g·L-1，維生素B110.0mg·L-1，瓊脂粉17g，pH=7[13]。

1.1.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基

馬玲薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41.0g·L-1，MgSO40.5g·L-1，維生素B110.0mg·L-1，pH=7[14]。

1.2 試劑與溶液

花生餅粉、黃豆粉、土豆(市售)；瓊脂(生物試劑)，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨(分析純)，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；可溶性淀粉(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；(NH4)2SO4、乙醇(均為分析純)，天津市福晨化學(xué)試劑廠；維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B6、NAA、IAA，華中藥業(yè)有限公司；葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、糊精、蛋白胨、牛肉浸粉、氯化氨、尿素、KH2PO4、K2HPO4、Fe2SO4、KNO3、NaCl、NaNO2、NaOH、Al(Cl)3(均為分析純)，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)品(純度>98%)，成都德斯特生物。

1.3 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；752型可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；恒溫?fù)u床，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；超凈工作臺，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌種活化

將7株羊肚菌菌種置于超凈工作臺，用接種鋤挑取0.5cm2菌餅塊轉(zhuǎn)接于菌種活化培養(yǎng)基，24℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長滿后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.1 羊肚菌一級種的制備

液體發(fā)酵培養(yǎng)基高壓滅菌后置超凈工作臺中接種，160r·min-1，24℃恒溫培養(yǎng)7d。

2.1.2 羊肚菌二級搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將一級菌種按5%接種量接于二級搖瓶中，160r·min-1，24℃恒溫培養(yǎng)7d。

2.1.3 最適培養(yǎng)基條件單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.3.1 添加不同碳源培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)

羊肚菌二級搖瓶中分別加入20g可溶性淀粉、蔗糖、山梨醇、乳糖、糊精代替葡萄糖，其他培養(yǎng)基成分同1.1.2，160r·min-1，24℃恒溫培養(yǎng)7d。

2.1.3.2 添加不同氮源培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)

方法同2.1.4.1。

2.1.3.3 添加不同無機(jī)鹽培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)

方法同2.1.4.1。

2.1.3.4 添加不同生長因子培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)

方法同2.1.4.1。

2.1.4 最適培養(yǎng)基條件正交試驗(yàn)

選取碳源(A)、氮源(B)、無機(jī)鹽(C)、生長因子(D)4個(gè)因素，每組重復(fù)3次，以胞外黃酮含量為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素及水平

2.2 最適發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵溫度試驗(yàn)

以確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配料，分別在18℃、20℃、22℃、26℃、28℃的恒溫?fù)u床上以轉(zhuǎn)速160r·min-1振蕩培養(yǎng)7d。

2.2.1.1 發(fā)酵轉(zhuǎn)速試驗(yàn)

以確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配料，在24℃恒溫?fù)u床上以轉(zhuǎn)速130r·min-1、145r·min-1、175r·min-1、190r·min-1、205r·min-1代替160r·min-1振蕩培養(yǎng)7d。

2.2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH試驗(yàn)

以確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配料，用鹽酸和氫氧化鈉設(shè)置不同的pH梯度，5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，后續(xù)同2.1.3。

2.2.1.3 發(fā)酵時(shí)間試驗(yàn)

以確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配料，操作同2.1.3，在24℃恒溫?fù)u床上以轉(zhuǎn)速160r·min-1進(jìn)行振蕩培養(yǎng)5d、6d、7d、8d、9d、10d。

2.2.2 最適培養(yǎng)基條件正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對發(fā)酵培養(yǎng)溫度(A)、轉(zhuǎn)速(B)、時(shí)間(C)、初始pH(D)這4個(gè)影響因素進(jìn)行3水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2。

表2 條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)

2.2.3 胞外黃酮含量的測定

胞外黃酮含量采用NaNO2-NaOH-Al(NO3)3比色法[16]測定，具體操作計(jì)算參考標(biāo)準(zhǔn)[17]進(jìn)行；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0122x-0.0082，R2=0.9986。

2.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組試驗(yàn)都以3組重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”作為最終結(jié)果。用Excel對各試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行圖表處理和數(shù)據(jù)方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 7株羊肚菌菌株胞外黃酮的比較

如圖1所示，不同菌株間黃酮含量差異明顯，Y-3菌株胞外黃酮含量最高，達(dá)到37.524mg·L-1，Y-5菌株胞外黃酮含量較高，達(dá)到26.778mg·L-1；其他羊肚菌菌株胞外黃酮含量較低。因此后續(xù)試驗(yàn)采用Y-3菌株進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 7株羊肚菌胞外黃酮產(chǎn)量

3.2 培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2、圖3可以得出，葡萄糖為最佳碳源，尿素為最佳氮源，KH2PO4為最佳氮源，維生素B6為最佳生長因子。

圖2 碳源及氮源篩選

圖3 無機(jī)鹽及生長因子篩選

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

3.4 液體發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖4、圖5可以得出，17℃為最佳溫度，170r·min-1為最佳轉(zhuǎn)速，8d為最佳天數(shù)，最佳pH值為7。

圖4 溫度及轉(zhuǎn)速篩選

圖5 天數(shù)及pH篩選

3.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)方差分析

4 討論

不同培養(yǎng)物質(zhì)及培養(yǎng)條件對胞外黃酮產(chǎn)量有著重要的影響。黃世群等研究表明羊肚菌的總黃酮含量為0.170%[18]，盧可可等研究表明云南、西藏和新疆產(chǎn)地的尖頂羊肚菌多酚組分主要為酚酸和黃酮，其平均總酚含量為5.958mgGAE·g-1，但三產(chǎn)地含量差異顯著[19]。本研究進(jìn)行初始菌株的篩選，從7株不同的羊肚菌菌株(Y-1～Y-7)中篩選出1株胞外黃酮產(chǎn)量最高的菌株；采用單因素實(shí)驗(yàn)以及正交試驗(yàn)對羊肚菌轉(zhuǎn)化黃酮培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，篩選出的菌株Y-3作為優(yōu)化菌株。結(jié)果表明：菌株Y-3葡萄糖20.0g·L-1，尿素6.0g·L-1，K2HPO44.0g·L-1，維生素B60.01g·L-1、MgSO40.5g·L-1；最佳培養(yǎng)條件為溫度17℃，轉(zhuǎn)速170r·min-1，pH=7，培養(yǎng)時(shí)間8d。此條件下的羊肚菌轉(zhuǎn)化黃酮量提升至107.105mg·L-1，較優(yōu)化前提高了285.4%。工藝優(yōu)化結(jié)果經(jīng)驗(yàn)證，方法穩(wěn)定有效，操作簡單，對儀器設(shè)備要求低，可為羊肚菌黃酮類化合物在其抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗菌、抗過敏等作用研究提供一定理論基礎(chǔ)。