鄧 瑩 劉 杰 魏學(xué)軍 夏 朵 馬江蠶

黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000

玄參為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根，具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)的功能，臨床常用于治療熱病熱入營血、溫毒發(fā)斑、熱病傷陰、舌絳煩渴、津傷便秘、骨蒸勞嗽、目赤、咽痛、白喉、瘰疬與癰腫瘡毒等癥候，主產(chǎn)浙江、貴州、四川與河北等省區(qū)[1]。

發(fā)汗作為中藥材產(chǎn)地加工的一種特殊方法，是影響中藥材質(zhì)量的重要因素之一，它可使藥材變色、變軟、增加香味或減少刺激性，其加工方法為將藥材用微火烘或曬至半干或微蒸(煮)后堆置起來，使其內(nèi)部發(fā)熱而析出水分[2]。玄參的發(fā)汗方法在2020版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定為“冬季莖葉枯萎時(shí)采挖，除去根莖、幼芽、須根及泥沙，烘或曬至半干后堆放3～6 d，反復(fù)操作，直至干燥”[1]。但由于地域的差異性，目前在玄參的產(chǎn)地加工方法中，除了按照《中華人民共和國藥典》規(guī)定的“發(fā)汗”方法加工之外，不同產(chǎn)地所采用的“發(fā)汗”方法各不相同[3]，已報(bào)道的文獻(xiàn)中玄參“發(fā)汗”的質(zhì)控指標(biāo)僅局限于核苷類成分[4]，而玄參的主要化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷類、有機(jī)酸類等化學(xué)成分[5]，其中哈巴苷、哈巴俄苷具有抗炎作用[6-7]，肉桂酸具有瀉下、抗細(xì)菌和真菌作用[8]，是玄參的主要生物活性成分。因此，本研究擬以哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸三種指標(biāo)性成分的含量作為考察指標(biāo)，比較“藥典發(fā)汗”曬干品和烘干品、“蒸后發(fā)汗”曬干品和烘干品、“煮后發(fā)汗”曬干品和烘干品玄參中上述指標(biāo)性成分含量，以綜合評(píng)分法優(yōu)選黔產(chǎn)玄參的“發(fā)汗”方法，以期為黔產(chǎn)玄參產(chǎn)地加工方法的建立提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 試驗(yàn)用新鮮玄參購于貴州省遵義市道真縣玄參種植基地，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校中藥教研室李香教授鑒定為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl.的根。哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸對(duì)照品均購自成都克洛瑪生物科技有限公司(批號(hào)：CHB-H-006，CHB190105，CHB190106)，乙腈(色譜純)，水為娃哈哈純凈水，余試劑均為分析純。

1.2 儀器 高效液相色譜儀Agilent1260型(美國Agilent公司)；SG-4050C型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海碩光公司)；AE240型電子分析天平(瑞士MettLer公司)；AS10200A 型超聲波清洗機(jī)(杭州匯爾公司)；DHG-9240A型真空干燥箱(上海金山公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣本的確定試驗(yàn) 藥材經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的總量符合2020版《中國藥典》規(guī)定(不少于0.45%)。

2.2 樣品的制備

2.2.1 藥典“發(fā)汗”曬干品(A1)[1]按《藥典》記載方法操作。將新鮮玄參洗凈后，曬至半干，于陰涼通風(fēng)處堆放 3 d，取出，曬 1 d 后再堆放，反復(fù)發(fā)汗6次即可干燥。

2.2.2 藥典“發(fā)汗”烘干品(A2)[1]按《藥典》記載方法操作。將新鮮玄參洗凈后，于 60 ℃ 烘至半干，于陰涼通風(fēng)處堆放 3 d，取出，60 ℃ 烘 30 min 后再堆放，反復(fù)發(fā)汗3次即可干燥。

2.2.3 蒸后“發(fā)汗”曬干品(A3) 將新鮮玄參洗凈后，于籠屜內(nèi)隔水蒸 30 min(按“圓氣”后計(jì))后，取出，曬至半干，余步驟同“2.2.1”項(xiàng)。

2.2.4 蒸后“發(fā)汗”烘干品(A4) 將新鮮玄參洗凈后，于籠屜內(nèi)隔水蒸 30 min(按“圓氣”后計(jì))后，取出，于 60 ℃ 烘至半干，余步驟同“2.2.2”項(xiàng)。

2.2.5 煮后“發(fā)汗”曬干品(A5) 將新鮮玄參洗凈后，于沸水中煮 30 min 后，撈出，曬至半干，余步驟同“2.2.1”項(xiàng)。

2.2.6 煮后“發(fā)汗”烘干品(A6) 將新鮮玄參洗凈后，于沸水中煮 30 min 后，撈出，于 60 ℃ 烘至半干，余步驟同“2.2.2”項(xiàng)。

2.3 哈巴苷、哈巴俄苷的測(cè)定方法[1]

2.3.1 色譜條件 880975-902C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.03%磷酸水(B)，流動(dòng)相梯度條件見表1。流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL；柱溫 20 ℃；檢測(cè)波長 210 nm。對(duì)照品溶液、供試品溶液HPLC色譜圖如圖1所示。

表1 流動(dòng)相梯度條件

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取A1～A6玄參樣品粉末(過三號(hào)篩)各 0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇 50 mL，密塞稱重，浸泡 1 h，超聲提取(功率 500 W，頻率 40 KHZ)45 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取哈巴苷對(duì)照品 6.05 mg、哈巴俄苷對(duì)照品 2.32 mg，置于 100 mL 量瓶中，加30%甲醇稀釋成含哈巴苷 60.50 μg/mL、哈巴俄苷 23.20 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，冷藏備用。

2.4 肉桂酸的測(cè)定方法

2.4.1 色譜條件 880975-902C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水(40∶60)；流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL；柱溫 25 ℃；檢測(cè)波長 285 nm。對(duì)照品溶液、供試品溶液HPLC色譜圖如圖2所示。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取A1～A6玄參樣品粉末(過三號(hào)篩)各 1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇 20 mL，密塞稱重，浸泡 1 h，超聲提取(功率 500 W，頻率 40 KHZ)30 min，提取3次，合并濾液定容至 100 mL，用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取肉桂酸對(duì)照品 1.0 mg，置于 100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋成含肉桂酸 10 μg/mL 的對(duì)照品溶液，冷藏備用。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取哈巴苷和哈巴俄苷混合對(duì)照品溶液、肉桂酸對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25 μL，按照“2.3.1”項(xiàng)下哈巴苷、哈巴俄苷和“2.4.1”項(xiàng)下肉桂酸色譜條件進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(μg/mL)為橫坐標(biāo)X、峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 方法學(xué)考察 精密吸取哈巴苷和哈巴俄苷混合對(duì)照品溶液、肉桂酸對(duì)照品溶液各 10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下哈巴苷、哈巴俄苷色譜條件和“2.4.1”項(xiàng)下肉桂酸色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果哈巴苷峰面積RSD=0.76%，哈巴俄苷峰面積RSD=0.63%，肉桂酸峰面積RSD=1.3%，表明儀器精密度良好。取A1樣品粉末(過三號(hào)篩)，6份，精密稱定，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備哈巴苷、哈巴俄苷供試品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備肉桂酸供試品溶液，分別依色譜條件測(cè)定并計(jì)算哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸含量，結(jié)果哈巴苷含量RSD=1.18%，哈巴俄苷含量RSD=1.78%，肉桂酸含量RSD=1.82%，表明該方法重復(fù)性良好。精密吸取哈巴苷和哈巴俄苷對(duì)照品溶液、肉桂酸對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 按相應(yīng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果哈巴苷含量RSD=1.14%，哈巴俄苷含量RSD=1.88%，肉桂酸含量RSD=0.81%，表明哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸對(duì)照品在 24 h 內(nèi)保持穩(wěn)定。取 0.25 g 哈巴苷含量為 0.53 mg、哈巴俄苷含量為 0.73 mg 的A1樣品6份，精密稱定，按表3精密加入適量哈巴苷、哈巴俄苷對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備哈巴苷和哈巴俄苷供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算加樣回收率；另取 0.5 g 肉桂酸含量為 0.46 mg 的A1樣品，6份，精密稱定，按表3精密加入適量肉桂酸對(duì)照品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備肉桂酸供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.8 樣品含量測(cè)定 精密稱取A1～A6玄參樣品粉末(過三號(hào)篩)各 0.5 g，按“2.3.2”方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算哈巴苷和哈巴俄苷含量，結(jié)果見表4。精密稱取A1～A6玄參樣品粉末(過三號(hào)篩)各 1.0 g，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算肉桂酸含量。結(jié)果見表4。

表4結(jié)果顯示，不同“發(fā)汗”加工方法對(duì)玄參中三種指標(biāo)性成分的含量均有影響。從《藥典》記載的定量指標(biāo)哈巴苷和哈巴俄苷的總量來評(píng)價(jià)，各種“發(fā)汗”方法的制品均符合《藥典》規(guī)定的含量要求。

表4 不同“發(fā)汗”加工方法哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

2.9 綜合評(píng)分法 優(yōu)選玄參的“發(fā)汗”方法根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]，采用綜合評(píng)分法優(yōu)選玄參“發(fā)汗”方法。在數(shù)據(jù)處理時(shí)引用指標(biāo)隸屬度，即指標(biāo)隸屬度=(指標(biāo)最大值-指標(biāo)值) /(指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值) 。根據(jù)各指標(biāo)在玄參中的重要性，考慮以哈巴苷占35%、哈巴俄苷占35%、肉桂酸占30%的權(quán)重，實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)分=哈巴苷占隸屬度×35%+哈巴俄苷隸屬度×35%+肉桂酸隸屬度×30%，總分為1.00分。評(píng)分結(jié)果以綜合分?jǐn)?shù)作為總指標(biāo)進(jìn)行直觀分析。結(jié)果見表5。

表5 綜合評(píng)分

從表5的綜合評(píng)分來看，得分最高的是A4樣品，即蒸后發(fā)汗烘干品。因此，通過綜合評(píng)分篩選出的玄參最佳發(fā)汗方法為：將新鮮玄參洗凈后，于籠屜內(nèi)隔水蒸 30 min(按“圓氣”后計(jì))后，取出，于 60 ℃ 烘至半干，于陰涼通風(fēng)處堆放 3 d，取出，60 ℃ 烘 30 min 后再堆放，反復(fù)發(fā)汗3次。

3 討論

藥材在干燥過程中，含黏液質(zhì)、淀粉或糖較多的藥材不易干燥，經(jīng)蒸、煮或燙處理后，則易干燥，而玄參氣味有明顯的焦糖氣[2]，且已有文獻(xiàn)資料[10]顯示玄參中多糖含量達(dá)13.83%。因此，實(shí)驗(yàn)中樣品制備方法的選擇在2020版《中國藥典》規(guī)定的玄參產(chǎn)地加工方法的基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)[11-14]增加了“蒸后發(fā)汗”曬干品和烘干品、“煮后發(fā)汗”曬干品和烘干品。從發(fā)汗的時(shí)間來看，“蒸后發(fā)汗”和“煮后發(fā)汗”大大縮短了后續(xù)的曬或烘的時(shí)間。從哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸含量的綜合評(píng)分來看，“蒸后發(fā)汗”品的綜合評(píng)分明顯高于“藥典發(fā)汗”品和“煮后發(fā)汗”品，其中“蒸后發(fā)汗”烘干品的綜合評(píng)分最高(0.9695)，但“煮后發(fā)汗”品綜合評(píng)分相對(duì)較低，分析原因可能是新鮮玄參在煮的過程中與水接觸導(dǎo)致哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸溶出。此外，每一種“發(fā)汗”烘干品的綜合評(píng)分都高于曬干品，推測(cè)其原因可能是烘干品干燥的時(shí)間較短，減少了玄參中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸三種有效成分的氧化或水解[15]。

黔產(chǎn)玄參的采收時(shí)間為10～11月，而此時(shí)貴州天氣陰冷潮濕，平均溫度為9～15 ℃，預(yù)實(shí)驗(yàn)在 15 ℃、20 ℃、25 ℃ 溫度下考察“發(fā)汗”溫度時(shí)，發(fā)現(xiàn) 20 ℃ 以上溫度“發(fā)汗”都會(huì)使玄參發(fā)霉變質(zhì)，因此本試驗(yàn)中所有樣品“發(fā)汗”的溫度均為 20 ℃ 以下的貴州常溫，且樣品干燥方法采用曬干法時(shí)，由于空氣中水分含量較高，曬干的時(shí)間較長，增加了時(shí)間成本。因此，結(jié)合貴州的氣候特點(diǎn)，建議黔產(chǎn)玄參“發(fā)汗”過程中干燥時(shí)采用烘干法，發(fā)汗樣品的處理采用“蒸后發(fā)汗”法，該方法可為黔產(chǎn)玄參產(chǎn)地加工方法的建立提供參考。對(duì)于黔產(chǎn)玄參的發(fā)汗機(jī)制和藥理作用還需進(jìn)一步深入研究。