胥思彤 朱旭江 王蘭霞* 劉 競 葉 青 高嘉雯 張邁娜

1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730000

前列安通片是由關黃柏、赤芍、丹參、桃仁、澤蘭、烏藥、王不留行和白芷組成的復方制劑，具有清熱利濕、活血化淤之功效，用于治療濕熱淤阻證，癥見尿頻、尿急、排尿不暢、小腹脹痛等，常用于治療前列腺炎類疾病[1-3]。其中君藥關黃柏中生物堿類成分、臣藥赤芍和丹參中芍藥苷、芍藥內酯苷和丹酚酸B具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、降壓、抗氧化、抗腫瘤等作用[4-6]。目前，前列安通片的質量標準中只包含關黃柏和赤芍的鑒別項目和鹽酸小檗堿的含量測定項目，缺少對其他有效成分的檢測，不能全面反映其質量。本實驗通過TLC法和UPLC法對前列安通片中各成分進行定性鑒別及定量檢測，并結合化學計量學分析方法綜合評價制劑質量，分析批次間的差異，以期為更為全面、合理地評控前列安通片的質量提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 自動薄層點樣儀及成像儀(瑞士CAMAG公司)；ME 204(0.1 mg)、MS205(0.01 mg)、XPE26(0.001 mg)電子天平(瑞士METTLER公司)；KQ-500DE超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；硅膠G薄層板(德國Merck公司、青島海洋化工有限公司)；Agilent 1290 UPLC色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.2 材料 前列安通片(批號：2001086001、2003086303、2004086001、2004088301、2004090301、2005086301、2005088301、2005087001、2005088301、2006086001)由甘肅獨一味生物制藥股份有限公司提供。關黃柏、丹參、赤芍、白芷對照藥材(批號分別為：120937-201408、120923-201816、12093-201303、120945-2201510)均購自中國食品藥品檢定研究院。原兒茶醛(批號：110810-201608，純度：99.3%)、芍藥苷(批號：110736-201943，純度：95.1%)、鹽酸小檗堿(批號：110713-201814，純度：86.7%)、鹽酸黃柏堿(批號：11895-201805，純度：94.9%)、鹽酸巴馬汀(批號：110732-201913，純度：85.7%)、丹酚酸B(批號：11562-201716，純度：94.1%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；木蘭花堿(批號：wkq20031310，純度：98%)、芍藥內酯苷(批號：wkq20040106，純度：98%)對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司。乙腈為色譜純，購自德國Merck公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 關黃柏鑒別 取1.0 g樣品粉末、0.2 g關黃柏對照藥材和1.0 g缺關黃柏陰性樣品，加乙酸乙酯20 mL，超聲30 min，過濾，蒸至1.5 mL，即得供試品液、關黃柏對照藥材液和陰性樣品液。將8 μL的上述3種溶液點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(1∶1)展開，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至顯色，顯出與關黃柏對照藥材相同顏色的主斑點，陰性無干擾。如圖1 A所示。

2.1.2 赤芍鑒別 取1.0 g樣品粉末、0.1 g赤芍對照藥材和1.0 g缺赤芍陰性樣品，加無水乙醇25 mL，超聲20 min，過濾，蒸至1.5 mL，即得供試品液、赤芍對照藥材液和陰性樣品液。取芍藥苷對照品適量，加甲醇制成0.5 mg/mL的對照品液。將4 μL對照藥材液及8 μL其余3種溶液點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶12∶0.2)展開，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至顯色，顯出與赤芍對照藥材、芍藥苷對照品相同顏色的主斑點，陰性無干擾。如圖1 B所示。

2.1.3 丹參鑒別 取6.0 g樣品粉末、1.0 g丹參對照藥材和6.0 g缺赤芍陰性樣品，加水100 mL，加熱煮30 min，離心，取上清液，用乙酸乙酯提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL，即得供試品液、丹參對照藥材液和陰性樣品液。取原兒茶醛對照品適量，加甲醇制成0.2 mg/mL的對照品液。將10 μL上述4種溶液點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(10∶1∶1)展開，噴以3%三氯化鐵乙醇溶液顯色，顯出與丹參對照藥材、原兒茶醛對照品相同顏色的主斑點，陰性無干擾。如圖1 C所示。

2.1.4 白芷鑒別 取3.0 g樣品粉末、1.0 g白芷對照藥材和3.0 g缺赤芍陰性樣品，加水100 mL,加熱煮30 min，離心，取上清液，用鹽酸調節(jié)pH值至2～3，二氯甲烷提取2次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL，即得供試品液、白芷對照藥材液和陰性樣品液。將5 μL上述3種溶液點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇(20∶1)展開，置紫外燈光(365 nm)下檢視，顯出與白芷對照藥材相同顏色的熒光主斑點，陰性無干擾。如圖1 D所示。

A.關黃柏;B.赤芍;C.丹參;D.白芷；1.陰性樣品液；2.對照品液；3.對照藥材液；4-13.供試品液；

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC CSH-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%～10%A；5～8 min，10%A；8～10 min，10%～12%A；10～14 min，12%～17%A；14～16 min，17%～21%A；16～18 min，21%A；18～23 min，21%～60%A)；流速：0.4 mL/min；檢測波長：230 nm(木蘭花堿、芍藥內酯苷、芍藥苷)、286 nm(鹽酸黃柏堿)、345 nm(鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B)；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。

2.2.2 對照品溶液 分別稱取鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、芍藥內酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B的對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度分別為5.504 μg/mL、29.831 μg/mL、21.599 μg/mL、22.862 μg/mL、36.726 μg/mL、11.038 μg/mL、24.428 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 樣品溶液 取適量去包衣樣品粉末，精密稱定0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，冷卻后再稱定重量，用50%甲醇補足損失重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按質量標準中處方的比例及制法，分別制為缺關黃柏、赤芍、丹參的陰性樣品，按上述方法制備成陰性樣品溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適應性試驗 取“2.2.2、2.2.3、2.2.4”項下溶液，按上述方法進樣測定。結果如圖2所示。由圖2可知，7種成分與相鄰組分均達到基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數均不低于10000，樣品溶液中的7個指標成分的色譜峰與對照品溶液相對應，缺關黃柏陰性在鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀色譜峰處無檢出、缺赤芍陰性在芍藥內酯苷、芍藥苷色譜峰處無檢出、缺丹參陰性在丹酚酸B色譜峰處無檢出。

1.鹽酸黃柏堿；2.木蘭花堿；3.芍藥內酯苷；4.芍藥苷；5.鹽酸小檗堿；6.鹽酸巴馬?。?.丹酚酸B

2.2.6 線性關系考察 精密稱取鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、芍藥內酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B的對照品 2.90 mg、7.61 mg、5.51 mg、6.01 mg、10.59 mg、3.22 mg、6.49 mg，置于50 mL容量瓶中，加50%甲醇制成對照品儲備液。將對照品儲備液加50%甲醇分別稀釋成2、5、10、25倍的稀釋液。按上述方法進樣測定5種不同濃度的對照品溶液，以峰面積為縱軸，對照品濃度為橫軸，進行線性回歸。結果見表1。

表1 各成分線性關系

2.2.7 精密度試驗 取混合對照品適量，按上述方法制備，連續(xù)6次測定，測得鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、芍藥內酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B的峰面積RSD(n=6)分別為0.80%、1.32%、1.85%、0.27%、0.83%、1.05%、0.52%，儀器的精密度良好。

2.2.8 重復性考察 取樣品(批號：2006086001)適量，按上述方法制備6份供試品溶液，進樣測定，測得鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、芍藥內酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B的含量RSD(n=6)分別為1.57%、1.96%、1.33%、1.63%、2.78%、2.63%、1.40%，該方法的重復性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.7”項下供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h測定，測得鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、芍藥內酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹酚酸B的峰面積RSD(n=7)分別為1.33%、1.14%、1.80%、1.44%、0.66%、1.04%、1.10%，樣品溶液24h內穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗 分別精密稱9份樣品(批號：2001086001)0.1 g，加入相當于已知含量的50%、100%、150%對照品儲備液，各3份。按上述方法制備，進樣測定，計算回收率和RSD。結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果

表2(續(xù))

2.2.11 樣品含量測定 取10批前列安通片樣品，按上述方法制備并進樣測定，計算含量。結果見表3。

表3 各成分含量測定結果 (mg/g，n=10)

2.2.12 化學計量學分析 將10批前列安通片測得的7種成分的兩次平行實驗數據含量測定結果作為變量，運用SPSS 19.0進行聚類分析。結果如圖3所示；運用SIMCA 14.1處理，并采用主成分分析法得到10批樣品得分圖和7種成分的載荷貢獻圖。如圖4、圖5所示。圖3顯示，可將10批前列安通片分為2類，其中批次2004086001、2004087301、2004090301、2005086301、2006086001為第一類；2001086001、2003086303、2004088301、2005087001、2005088301為第二類。圖4顯示，10批前列安通片可分為與聚類分析結果一致的2類。分析圖5發(fā)現，木蘭花堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿4種成分的權重占比較高，表明其對上述分類間的質量差異性有關鍵影響，4種成分均系關黃柏的特征成分。

圖3 10批樣品的聚類分析圖 (n=2)

圖4 10批樣品得分圖(n=2)

圖5 各成分的載荷貢獻圖

3 討論

3.1 TLC鑒別 本實驗對前列安通片中關黃柏、赤芍、丹參、白芷4味藥材的TLC鑒別條件進行了考察和優(yōu)化。為鑒定黃柏與關黃柏的混用情況，選擇可以鑒別關黃柏特有成分黃柏酮成分的方法[7-8]。此方法參考2020版《中國藥典》的關黃柏[鑒別]項下方法[7]，使關黃柏的鑒別更具專屬性。原標準中赤芍的TLC鑒別中使用乙醇提取，陰性對照品色譜中干擾較多，故選擇無水乙醇為提取溶液，且添加了赤芍對照藥材。白芷方法參考2020版《中國藥典》中川芎茶調丸[鑒別](3)項下方法[7]，同時比較了提取溶液二氯甲烷及三氯甲烷，提取pH值2～3及pH值10～12，最終確定此方法。

由于制作工藝需長時間高溫煎煮，有效成分易進行轉化，如在考察桃仁時出現斑點位置相同，顏色不一致的情況，故其余4味藥材TLC鑒別還需進一步研究。

3.2 含量測定

3.2.1 提取方法的選擇 本實驗考察了提取溶劑：(100%、70%、50%)甲醇、50%乙醇和水及超聲時間：15 min、30 min、45 min，發(fā)現為50%甲醇及超聲30 min時，對7種成分的提取值較高。

3.2.2 色譜條件的選擇 本實驗考察了流動相A：甲醇、乙腈，流動相B：0.1%、0.4%磷酸及0.1%甲酸；柱溫：30 ℃、35 ℃、40 ℃及體積流量：0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，并調整梯度條件[9-11]；在波長190～400 nm間進行光譜掃描，結合相關文獻[7,12-13]，綜合考慮各成分的分離度與峰型，最終建立的色譜條件如“2.2.1”項中所述，其中鹽酸黃柏堿在樣品中230 nm時分離度小于1.2，故選擇在286 nm檢測。比較同品牌規(guī)格為2.1 mm×100 mm,1.7 μm的CSH-C18和BEH-C18色譜柱，結果表明CSH-C18色譜柱對各成分的分離更好。

3.2.3 樣品分析 由表3可看出，不同批次樣品各成分含量的RSD均大于10%，說明各批次間均一性較差。結合主成分分析及聚類分析，發(fā)現批次間含量差異來源于關黃柏，說明其原因可能來自于投料時關黃柏的質量差異。查閱文獻[14-16]后發(fā)現，關黃柏藥材中生物堿類成分受種質、生長年限和產地的影響較大。同時也可能因廠家投料比例不精準及生產工藝的影響，對制劑質量產生影響。所以為提高不同批次間前列安通片質量的一致性，廠家在生產檢驗中應增加木蘭花堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿作為其指標成分，這樣更能夠準確控制前列安通片的質量并確保藥物的有效性。

為了提高前列安通片的一致性，廠家對采購的藥材，除了對關黃柏質量的把控，嚴格以藥典的品質標準進行，也應盡量規(guī)定其種質、產地及生長年限，即通過對藥源的限制從而控制前列安通片的質量。在加工生產中，注意不同批次間的投料比，并優(yōu)化生產工藝，提高不同批次間制劑質量的均一性。在質控中增加對關鍵成分木蘭花堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿的檢測項目，通過網絡化實時監(jiān)測，實現高效、有針對性地對前列安通片進行質量一致性評價。本實驗所建立的關黃柏、赤芍、丹參、白芷的TLC法及同時測定前列安通片中7種成分含量的UPLC法科學、準確，可為更為全面的評控前列安通片的質量提供參考價值。