朱姚鎵，劉宇璇，汪恒瑋，汪芷因，李 丹，吳嘉平

(浙江大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 舟山 316021)

羊棲菜(Sargassumfusiforme)是一種廣泛分布于西北太平洋海岸潮間帶的溫帶褐藻。羊棲菜中含有豐富的營養(yǎng)成分，例如褐藻硫酸多糖、甾醇類化合物、膳食纖維、蛋白質(zhì)和氨基酸等[1-2]，具有較高的食用價值。羊棲菜也被推崇為一種天然的治療劑，《中華人民共和國藥典》《神農(nóng)本草經(jīng)》等指出其具有消痰軟堅散結(jié)、治奔豚氣、消宿食、利水消腫等藥理作用[3-4]。此外，大規(guī)模的海藻養(yǎng)殖能夠吸收海水中大量的營養(yǎng)物質(zhì)，如氮、磷等[5]，大幅度減緩海水富營養(yǎng)化狀態(tài)[6]，吸收二氧化碳，釋放氧氣，提升海水pH，改善海水生態(tài)環(huán)境[7-9]。

長期以來，工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生活污水等不斷排放入海，對濱海水質(zhì)和沉積物造成了一定影響[10-11]。2020年全國直排海水中的六價鉻、鉛總量達(dá)到了2 153 kg和14 100 kg[12]。因海藻中的細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)能提供較多可與離子結(jié)合的官能團，且液泡等結(jié)構(gòu)能夠隔離和固定微量元素，故海藻易從周圍環(huán)境中富集各種離子[13-14]。雖然海藻能夠?qū)Ｋ械挠幸嫖⒘吭剡M(jìn)行吸收積累，但同時也能吸收積累一些有害離子如Pb2+、Cd2+、Cr2+等，進(jìn)而有可能通過攝入等方式對人體健康安全造成潛在風(fēng)險。

雖然近年來對羊棲菜的關(guān)注日益增多，但是主要針對其中的活性成分等[2,15]進(jìn)行研究，對微量元素含量的研究相對較少，且主要為針對羊棲菜整體的微量元素含量進(jìn)行測定[16-19]，對羊棲菜不同部位微量元素的分布與富集情況的報道尚不多見。在日本，經(jīng)常將羊棲菜的莖和氣囊等不同部位進(jìn)行分開售賣，故而對分部位羊棲菜的微量元素含量進(jìn)行分析、研究具有一定的理論意義和實用價值。

本研究對不同養(yǎng)殖區(qū)域成熟期羊棲菜4種可食部位(主莖、側(cè)莖、氣囊和生殖托)的7種微量元素As、Cd、Cr、Cu、Ni、Pb和Zn含量進(jìn)行分析測定，以研究微量元素在羊棲菜不同部位的分布特點和含量水平，同時采集養(yǎng)殖區(qū)海水進(jìn)行環(huán)境評估，并對羊棲菜中微量元素的食用風(fēng)險進(jìn)行評價。本研究旨在確定羊棲菜不同部位的微量元素分布特性，探討羊棲菜中的微量元素含量水平和食用安全性，為生產(chǎn)者和消費者食用部位的選擇提供參考，同時為今后羊棲菜資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及測定

1.1.1 研究區(qū)域概況 自然生長的羊棲菜主要附著在低潮帶巖石上。1989年，羊棲菜在人工試養(yǎng)成功后開始大面積推廣養(yǎng)殖，經(jīng)過30多年發(fā)展，2019年浙江溫州洞頭區(qū)的羊棲菜養(yǎng)殖面積達(dá)到了約906 hm2，產(chǎn)量達(dá)到了1.94萬噸，被譽為中國羊棲菜之鄉(xiāng)[20]。本研究在洞頭區(qū)的3個養(yǎng)殖區(qū)(勝利岙、仙疊巖和五嶼頭)進(jìn)行采樣(圖1)。

圖1 洞頭區(qū)采樣位點分布示意Fig. 1 Distribution of sampling stations in Dongtou District圖中S為勝利岙，X為仙疊巖，T為五嶼頭；下同。

1.1.2 樣品采集和前處理 2020年5月在洞頭區(qū)3個養(yǎng)殖區(qū)采集羊棲菜成熟期樣品，同時采集表層水樣。海藻樣品低溫運回實驗室后用去離子水清洗，去除表面附著物及淤泥顆粒，用紙巾吸干表面水分。將羊棲菜分為主莖、側(cè)莖、氣囊、生殖托4個部分，55 ℃烘干48 h后磨碎備用。海水采樣方法參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》[21]。

1.1.3 實驗方法 稱取羊棲菜不同部位樣品約0.1 g，加入5 mL HNO3，在恒溫石墨爐中消煮，期間加數(shù)次H2O2，煮至溶液澄清。冷卻至室溫后用去離子水稀釋定容至25 mL，靜置后取上清液待測。每個樣品平行測定3次，同時做空白對照組。

海藻及海水樣品中的As、Cd、Cr、Cu、Ni、Pb、Zn等微量元素用電感耦合等離子質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometer， ICP-MS)測定。分析中所用試劑均為優(yōu)級純，分析過程以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10023(紫菜)進(jìn)行質(zhì)量控制。實驗中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)回收率為92.5%～110.7%。

1.2 健康風(fēng)險評價

采用目標(biāo)危害系數(shù)法[22-23]對羊棲菜中的重金屬進(jìn)行健康風(fēng)險評價。該方法通過單一重金屬危害系數(shù)(target hazard quotient, THQ)和多種重金屬復(fù)合危害系數(shù)(total target hazard quotient, TTHQ)對通過食物途徑攝入重金屬的健康風(fēng)險進(jìn)行評估，其計算公式如下：

(1)

TTHQ=∑THQ

(2)

式(1)中：EF為暴露頻率(365 d/a)，ED為暴露持久性(30 a)，F(xiàn)IR為羊棲菜攝入率(20 g/標(biāo)準(zhǔn)人日)[16]，C為實驗測得的各重金屬含量(mg/kg)，RfD為經(jīng)口服攝入重金屬參考劑量[mg/(kg·d)]，其中As、Cd、Cr、Cu、Ni、Pb、Zn分別為3.0×10-4、1.0×10-3、3.0×10-3、4.0×10-2、2.0×10-2、3.5×10-3、0.3 mg/(kg·d)[22-24]，WAB為人體平均體重(63.45 kg)，TA為平均暴露時間(10 950 d)。

鑒于重金屬對人體健康的影響一般是由多種元素共同作用的結(jié)果，該方法的優(yōu)勢在于評價單一重金屬健康風(fēng)險的同時，對多種重金屬復(fù)合暴露的健康風(fēng)險進(jìn)行評估。如果THQ或TTHQ指數(shù)小于1.00，則說明暴露人群沒有明顯的健康風(fēng)險，反之，則說明相關(guān)暴露人群可能存在健康風(fēng)險。

1.3 元素富集系數(shù)

元素富集系數(shù)(bioconcentration factor, BCF)為海藻吸收和積累環(huán)境中微量元素能力的指標(biāo)，其計算公式[25-26]為

(3)

式(3)中：CS為海藻中微量元素含量(mg/kg)，CW為海水中微量元素含量(μg/L)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2019和DPS 16.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Duncan新復(fù)極差檢驗進(jìn)行差異性分析，顯著水平設(shè)定為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊棲菜各部位重金屬含量

羊棲菜不同部位的微量元素分布特征見圖2。羊棲菜中微量元素總體平均含量較高的為As(26.37～84.00 mg/kg)和Zn(29.37～44.64 mg/kg)，其次為Cu(3.91～9.94 mg/kg)和Ni(1.18～2.57 mg/kg)，Cd(0.32～1.08 mg/kg)、Cr(0.60～1.30 mg/kg)和Pb(0.82～1.38 mg/kg)的含量較低。從圖2可知，對于As、Cd、Cr和Cu而言，雖然各元素含量隨著區(qū)域的不同而存在一定差異，但生殖托和氣囊中的含量顯著高于主莖和側(cè)莖中的含量(P<0.05)。在3個站位中，羊棲菜的As和Cr含量在站位X中最高，Cd和Cu含量在站位T中最高。對于元素Ni、Pb和Zn而言，不同部位的羊棲菜含量存在顯著差異(P<0.05)，不同站位間的元素含量分布特征也存在一定差異。

圖2 羊棲菜中各部位微量元素含量Fig. 2 Concentrations of trace elements in different tissues of Sargassum fusiforme不同英文小寫字母表示數(shù)值之間差異顯著(P<0.05)。

2.2 海藻微量元素富集能力

表1為各采樣站位海水中的微量元素含量。從表中可以看出，海水中微量元素的分布為：Zn > As > Cr/Cu/Ni > Pb > Cd。與海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[27]對照，除了Zn元素為二類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)外，其他元素含量達(dá)到了一類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。3個區(qū)域中，站位T的海水水質(zhì)狀況相對較好。

表1 各采樣位點海水中微量元素含量

實驗測得羊棲菜體內(nèi)微量元素含量均高于周圍海水中的含量，說明羊棲菜具有較強的元素富集能力(表2)。羊棲菜富集系數(shù)計算結(jié)果表明，羊棲菜中As的富集系數(shù)最高，Cr在羊棲菜中的富集系數(shù)最低。而不同站位的羊棲菜對微量元素的富集特征存在一定差異，站位S的羊棲菜對Zn的富集系數(shù)最高，站位T對Cd的富集系數(shù)最高，位點X對As、Cr、Cu、Ni和Pb的富集系數(shù)最高。

表2 羊棲菜微量元素富集系數(shù)

2.3 海藻各部位富集能力綜合評價

對羊棲菜中各微量元素含量進(jìn)行主成分分析(principal component analysis， PCA)，根據(jù)特征方差累計貢獻(xiàn)率確定主成分個數(shù)。由圖3可知，前3個主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到87.4%，基本保留了原有數(shù)據(jù)的基本信息。第一主成分(PC1)的貢獻(xiàn)率為38.1%，該變量在As、Cd、Cr和Cu上有相似正載荷(0.40～0.53)；第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率為27.4%，該變量在Ni上有較高正載荷(0.66)，表明第二主成分主要支配著羊棲菜中Ni的富集能力；第三主成分(PC3)的貢獻(xiàn)率為21.9%，Zn和Pb有著較高的正載荷，分別為0.62和0.54。

根據(jù)主成分分析結(jié)果，提取前3個主成分對羊棲菜中微量元素的富集能力進(jìn)行綜合評價(表3)。由表3可知，站位X和站位T羊棲菜各部位對微量元素的富集能力排序為生殖托>氣囊>側(cè)莖>主莖。站位S羊棲菜各部位對微量元素的富集能力排序為氣囊>側(cè)莖>生殖托>主莖。相比較而言，三個區(qū)域中站位S的羊棲菜的富集能力較弱。由結(jié)果可知，羊棲菜氣囊對于微量元素的富集能力較強，主莖和側(cè)莖對于微量元素的富集能力較弱?？紤]到生殖托為羊棲菜僅在成熟期產(chǎn)生的特殊部位，故而生殖托對微量元素的富集能力差異可能與其生長時間存在一定關(guān)聯(lián)。

圖3 各微量元素的二維載荷系數(shù)圖Fig. 3 2-dimensional loading plots of the trace elementsPC1貢獻(xiàn)率為38.1 %，PC2貢獻(xiàn)率為27.4 %，PC3貢獻(xiàn)率為21.9 %。

表3 羊棲菜各站位不同部位微量元素富集能力的綜合得分

2.4 健康風(fēng)險評估

羊棲菜微量元素的健康風(fēng)險評估結(jié)果見圖4。從單一微量元素的風(fēng)險來看，各微量元素的THQ值均小于1.00，故各微量元素的攝入對人體健康不存在風(fēng)險。從微量元素的種類上來看，As和Cd對健康風(fēng)險的占比最高，THQ平均值達(dá)到了0.34和0.16。其次為元素Pb和Cr，THQ平均值約為0.10。元素Cu、Ni和Zn引起的健康風(fēng)險占比相對較低。

從微量元素復(fù)合風(fēng)險上來看，僅站位T和X的生殖托存在TTHQ大于1.00的情況，表明居民經(jīng)膳食單獨攝入這兩個站位的生殖托會存在一定風(fēng)險。而站位T和X的氣囊雖然尚屬安全，但TTHQ的值分別為0.95和0.98，十分接近1.00，存在一定的安全隱患，應(yīng)當(dāng)引起重視。總體而言，羊棲菜主莖和側(cè)莖的微量元素復(fù)合風(fēng)險低于生殖托和氣囊。因此，當(dāng)?shù)鼐用裥杩刂蒲驐松惩屑皻饽业臄z入，以減少潛在的微量元素攝入風(fēng)險。

2.5 討論

羊棲菜對各微量元素的吸收富集能力不同，故各微量元素的含量差異較大。羊棲菜中Zn和Cu含量相對較高，而此類元素是植物生長所必需的微量元素，是生物體內(nèi)多種酶的組成成分，對海藻體內(nèi)的生命活動有著較為重要的作用[13]。元素Ni、Pb、Cr和Cd的含量相對較低，考慮到這些元素具有高生物毒性[24]，羊棲菜對這部分微量元素可能存在選擇性吸收。此外本研究表明，因生長地域的差異，羊棲菜的元素含量和富集程度也存在較大差別。以往的研究表明，海洋環(huán)境污染會使藻體內(nèi)元素含量與水環(huán)境中元素含量達(dá)到動態(tài)平衡并呈現(xiàn)線性關(guān)系[28]。不同海域海藻中的元素含量差異能有效地反映不同沿海系統(tǒng)各元素的動態(tài)變化，進(jìn)而反映水質(zhì)變化。Say等(1990)在英國1個未受污染、5個受污染河口采集滸苔屬(Enteromorpha)的樣本進(jìn)行Zn、Cd、Hg和Pb含量的測定，結(jié)果表明，不同河口滸苔屬的元素含量存在差異，且未受污染河口的滸苔屬樣本中的元素含量相對較低[29]。Pise等(2013)通過對不同站位的Porphyravietnamensis中的重金屬含量、脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxidation, LPO)與過氧化氫(H2O2)等氧化應(yīng)激標(biāo)志物、抗氧化酶過氧化氫酶(catalase， CAT)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase， GST)等的測定結(jié)果表明，同一種海藻對不同的環(huán)境條件有不同的生化反應(yīng)[30]。本研究結(jié)果表明，羊棲菜不同部位對不同微量元素的富集能力存在顯著差異。從羊棲菜的生長環(huán)境而言，雖然所有部位均和海水環(huán)境直接接觸，但是不同部位的生長及發(fā)育階段不同，可能對微量元素的吸收富集產(chǎn)生不同的影響。對不同生長期龍須菜(Gracicilarialemaneiformis)中重金屬含量的歷史研究表明，不同生長期龍須菜對重金屬的富集能力不同，且隨著龍須菜的生長，元素的富集量增加[31]。針對壇紫菜(Porphyralhaitanensis)的兩個明顯異性世代——葉狀體和絲狀體的Cu脅迫結(jié)果表明，壇紫菜自由絲狀體對Cu離子的脅迫更為敏感，在急性毒理試驗中，在短時間內(nèi)，較低濃度下，其生長狀況已經(jīng)受到極顯著的抑制現(xiàn)象[32]。

圖4 羊棲菜微量元素單一及復(fù)合健康風(fēng)險評價Fig. 4 THQ and TTHQ of trace elements in Sargassum fusiforme圖中紅色虛線為健康風(fēng)險臨界線，當(dāng)健康風(fēng)險低于1.00時則說明暴露人群沒有明顯的健康風(fēng)險。

As元素在羊棲菜中的含量相對較高，但之前的研究表明，海藻中的As大多以毒性較小的有機態(tài)存在，目前已知的僅無機砷(包括三價砷和五價砷)對人體有致癌作用[33-34]。一般大部分微量元素主要貯存在細(xì)胞壁中，但As在細(xì)胞中的分布位置較為不同。有研究表明羊棲菜中As主要貯存在胞液中，在胞液中的分布比例達(dá)到了58%[13]。在實際的海藻生產(chǎn)中，加工過程中的洗滌、浸泡和蒸煮等步驟能夠降低最后成品中的As含量[35-36]，也有通過脫砷劑等方法對羊棲菜進(jìn)行脫砷處理，降低羊棲菜中的As含量[37]。除此之外有研究表明，Se能夠通過抗炎癥、抗氧化和抗凋亡等機制減輕As中毒的癥狀[38]。而Se是浙江產(chǎn)羊棲菜特殊的營養(yǎng)成分[39]，故而羊棲菜中的Se可能削弱了其中高含量的As對人體的影響。食用羊棲菜在日本有著十分久遠(yuǎn)的歷史，最早在1643年的料理書中就記載了羊棲菜的烹飪方法[40]?，F(xiàn)今羊棲菜仍是日本最受歡迎的海藻食品之一，調(diào)查報告顯示羊棲菜人均日攝入量為3.3 g[41]。目前并沒有證據(jù)表明這種水平的As暴露對人體造成有害影響。但是考慮到羊棲菜中As毒性的復(fù)雜性，關(guān)于羊棲菜中As的風(fēng)險評估仍需要進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

洞頭羊棲菜中微量元素的平均含量由高到底排序為As > Zn > Cu > Ni > Pb > Cr > Cd。針對羊棲菜不同部位而言，雖然元素As、Cd、Cr和Cu的具體含量差異隨著采樣區(qū)域的不同而存在一定差異，但生殖托和氣囊中的含量顯著高于主莖和側(cè)莖中的含量。羊棲菜對于As元素有較強的富集能力。從微量元素復(fù)合風(fēng)險上來看，部分站位的生殖托存在TTHQ略大于1.00的情況，長期食用對人體健康存在風(fēng)險。但考慮到部分元素在生物體內(nèi)不同形態(tài)的毒性不同，可能存在風(fēng)險高估的結(jié)果?？傮w而言，攝入羊棲菜主莖和側(cè)莖的微量元素復(fù)合風(fēng)險低于生殖托和氣囊。