楊求華

(福建省水產(chǎn)研究所、福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

仿刺參(Apostichopusjaponicus)隸屬于海參綱、辛那參目、刺參科、仿刺參屬(Apostichopus)，自然分布于北太平洋淺海，是我國海水養(yǎng)殖中重要的養(yǎng)殖品種之一。2020年全國海參養(yǎng)殖面積為24.28萬公頃，養(yǎng)殖產(chǎn)量為19.66萬噸，全產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)值突破600億元[1]。福建省自2003年起開展“北參南養(yǎng)”實(shí)驗(yàn)，近年來發(fā)展迅速，至2020年全省養(yǎng)殖產(chǎn)量為2.81萬噸，居全國第三，是我國南方最大的海參養(yǎng)殖產(chǎn)地，并形成了集苗種、養(yǎng)殖、加工、交易、存儲和產(chǎn)業(yè)金融為一體的全產(chǎn)業(yè)鏈體系[1]。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，仿刺參養(yǎng)殖疾病也時(shí)有發(fā)生，其中塔氏弧菌(Vibriotubiashii)、伯麥羅氏弧菌(V.pomeroyi)、燦爛弧菌(V.splendidus)等細(xì)菌性病原被先后報(bào)道[2-4]。常規(guī)的抗生素治療雖然在一定程度上緩解了水產(chǎn)養(yǎng)殖生物疾病的發(fā)生，但過度依賴和濫用抗生素已導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)出現(xiàn)嚴(yán)重問題[5-6]。閆倩倩等(2020)的研究結(jié)果顯示，在山東地區(qū)仿刺參腸道內(nèi)存在一定數(shù)量的耐藥菌，如弧菌屬(Vibrio)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)等，其中耐藥相關(guān)基因tetA、tetG、qnrA等的拷貝數(shù)要高于16S rDNA的相對含量[7]。因此，開展抗生素替代品的研究已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一個(gè)迫切任務(wù)。益生菌是在宿主體內(nèi)可發(fā)揮益生功能的微生物類群，可提高宿主免疫力，提高環(huán)境應(yīng)激和疾病抵御能力，提高宿主生長和改善腸道菌群穩(wěn)態(tài)[8-9]，成為當(dāng)前水產(chǎn)病害防治研究的熱點(diǎn)[10]。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生菌種類有乳酸菌，芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)等[11-12]。Maeda等(2014)采用1×105CFU/g菌濃度的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)D1813投喂日本對蝦(Marsupenaeusjaponicus)，而后用殺對蝦弧菌(V.penaeicida)浸泡攻毒，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組對蝦的累計(jì)成活率為61.7%，顯著高于對照組的28.3%[13]。Adel等(2016)的研究結(jié)果表明，乳酸乳球菌可顯著提高南美白對蝦(Litopenameivannamei)的生長速度、存活率和腸道酶活性[14]。本研究以仿刺參為實(shí)驗(yàn)對象，以乳酸乳球菌XP-15為候選菌株，研究乳酸乳球菌對仿刺參生長、免疫及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為該菌作為候選益生菌種在水產(chǎn)養(yǎng)殖特別是仿刺參養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌株：乳酸乳球菌XP-15為本研究從福建吊籠養(yǎng)殖仿刺參腸道中分離，并采用生理生化等方法進(jìn)行鑒定、保藏。

實(shí)驗(yàn)動物：健康仿刺參共240頭，購買自漳州某海參養(yǎng)殖基地。

1.2 方法

1.2.1 飼料制備 菌株XP-15添加飼料：將過夜培養(yǎng)的XP-15菌液用無菌生理鹽水調(diào)至OD600值為0.1，取150 mL菌液與300 g粉狀海參基礎(chǔ)飼料(威海金牌生物科技有限公司)混合，30 ℃、180 r/min搖床中震蕩混合2 h，使菌株XP-15的有效菌濃度為1×108CFU/g。

基礎(chǔ)飼料：將150 mL新鮮配制培養(yǎng)基添加至300 g海參基礎(chǔ)飼料，30 ℃、180 r/min搖床中震蕩混合2 h。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)管理 將240頭健康的仿刺參饑餓處理2 d后暫養(yǎng)7 d(基礎(chǔ)飼料投喂)，隨后隨機(jī)分成兩組，其中實(shí)驗(yàn)組(XP-15組)平均體質(zhì)量為(42.10±1.93) g，對照組(CK組)平均體質(zhì)量為(43.63±2.15) g，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行40頭。將仿刺參置于長寬高分別為1.2、0.5、0.8 m的水槽中進(jìn)行養(yǎng)殖，不間斷充氣，采用定時(shí)(08:00、20:00)、定量(日均投喂量約為體重的3%)投喂，實(shí)驗(yàn)組投喂菌株XP-15添加飼料，對照組投喂基礎(chǔ)飼料。采用流水養(yǎng)殖，投喂期間不流水，于投喂前用虹吸管清除殘余飼料和排泄物，每天觀察仿刺參攝食和生長情況。實(shí)驗(yàn)期間水溫為18～20 ℃，鹽度為26～28，pH為7.4～8.0，實(shí)驗(yàn)周期為8周。

1.2.3 生長指標(biāo) 至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，仿刺參停止投喂24 h后隨機(jī)抽取30頭測定平均體質(zhì)量，計(jì)算增重率(RWGR)，其公式為

(1)

式(1)中：Wt為終末體質(zhì)量(g)，W0為初始體質(zhì)量(g)。

1.2.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析 參照文獻(xiàn)[15]，采用MiSeq高通量測序方法分析仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)。于每周每組隨機(jī)挑選9頭仿刺參(每個(gè)平行取3頭)，無菌條件下取腸道及其內(nèi)容物，進(jìn)行混樣，提取DNA并電泳檢測，切膠回收產(chǎn)物送Illumina公司進(jìn)行微生物多樣性分析。

1.2.5 腸道免疫酶活力測定 第6周在每組隨機(jī)挑選9頭仿刺參(每個(gè)平行取3頭)，無菌條件下去除腸道內(nèi)容物，采集腸壁，每個(gè)平行的3頭仿刺參腸道進(jìn)行混樣，稱重后在預(yù)冷的研磨皿中進(jìn)行研磨，隨后按照免疫酶活力測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)方法進(jìn)行酶活力測定，測定指標(biāo)包括：一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)、溶菌酶(lysozyme, LZM)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)等，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6 人工感染實(shí)驗(yàn) 第8周時(shí)取部分仿刺參進(jìn)行免疫保護(hù)率實(shí)驗(yàn)，每組隨機(jī)挑選30頭仿刺參(每個(gè)平行取10頭)，隨機(jī)分成3個(gè)重復(fù)，采用體腔注射法進(jìn)行攻毒感染實(shí)驗(yàn)，選用半致死濃度(LD50)為2.05×105CFU/mL的南移仿刺參病原菌塔式弧菌[2]為實(shí)驗(yàn)菌株(菌濃度為1.00×108CFU/mL)，注射劑量為0.1 mL/頭，每天觀察并記錄仿刺參狀態(tài)及死亡情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0軟件單因素方差(ANOVA)進(jìn)行差異性顯著分析，并用Origin 8.0軟件和Excel 2017軟件進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株XP-15對仿刺參生長的影響

菌株投喂后的生長情況如表1所示，選擇初始體重分別為(43.63±2.15) g和(42.10±1.93) g的XP-15組和CK組仿刺參，經(jīng)過為期8周的投喂實(shí)驗(yàn)，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)XP-15組和CK組的終末體重分別為(96.91±3.34) g和(88.16±4.08) g，平均增重率分別為122.19%和109.46%；XP-15組的增重率顯著高于CK組(P<0.05)，表明菌株XP-15對仿刺參的生長具有一定的促進(jìn)作用，這可能是由于飼料中的乳酸乳球菌通過刺激仿刺參腸道消化酶的產(chǎn)生，從而提高飼料利用率，進(jìn)而提高仿刺參的生長性能。有研究結(jié)果表明，在水產(chǎn)動物中投喂益生菌可以改善其腸道菌群結(jié)構(gòu)并對飼料中一些營養(yǎng)因子進(jìn)行預(yù)消化，從而起到促進(jìn)宿主生長的效果[16-17]。周慧慧等(2010)在稚參期的仿刺參基礎(chǔ)飼料中添加芽孢桿菌屬菌株GSC-1、GSC-2和腸球菌屬菌株GSC-3等益生菌株，能有效提高其特定生長率[18]；Kong等(2020)在烏鱧(Channaargus)飼料中添加乳酸乳球菌，對魚體生長具有顯著的促進(jìn)作用[19]；此外在南美白對蝦[20]、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)[12]等物種的配合飼料中添加益生菌株，均起到了較好的生長促進(jìn)作用。

2.2 菌株XP-15對仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

菌株投喂后的仿刺參腸道微生物測序結(jié)果如圖1所示，在門水平上，XP-15組和CK組的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成包括厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍(lán)細(xì)菌門等，其中以厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門等3個(gè)門類為主。從菌群結(jié)構(gòu)變化趨勢上看，XP-15組的厚壁菌門和擬桿菌門呈現(xiàn)由低豐度向高豐度轉(zhuǎn)變的過程。其中厚壁菌門的相對豐度在7.82%～78.38%范圍內(nèi)，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，其中第5周時(shí)最高，為78.38%；至第8周時(shí)厚壁菌門的相對豐度為54.92%；其次為擬桿菌門的32.87%，而變形菌門的相對豐度由第1周的73.95%降至第8周的11.29%[圖1(a)]。在CK組則呈現(xiàn)不一樣的變化趨勢[圖1(b)]，其中厚壁菌門相對豐度呈現(xiàn)時(shí)高時(shí)低，比例基本維持在21.87%～93.06%不等，其中在第1周的相對豐度最高，達(dá)到93.06%，為腸道微生物組成的主要類群；而變形菌門呈現(xiàn)出增加趨勢，在第8周時(shí)相對豐度達(dá)到52.84%。高通量測序技術(shù)能夠擺脫傳統(tǒng)培養(yǎng)條件的限制，快速、準(zhǔn)確地對環(huán)境或者樣品中的細(xì)菌群落組成，特別是對不可培養(yǎng)細(xì)菌具有較好的鑒別能力[21]。有研究結(jié)果表明，厚壁菌門菌株至少含有44種與抗性淀粉酶降解有關(guān)的基因，因此厚壁菌門和擬桿菌門菌株可以幫助宿主降解其不能降解的多糖類物質(zhì)，從而為宿主生長提供能量[22]。

圖1 門水平上XP-15組和CK組腸道菌群結(jié)構(gòu)組成Fig. 1 Composition of intestinal flora in XP-15 and CK groups at phylum level

在屬水平上，XP-15組的菌群結(jié)構(gòu)組成包括乳球菌屬(Lactococcus)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、不動桿菌屬(Lutibacter)、弧菌屬、片球菌屬(Pediococcus)、紅球菌屬(Rhodococcus)等[圖2(a)]，隨著投喂時(shí)間的增加，仿刺參腸道中乳球菌屬的相對豐度逐漸增加，在第7周時(shí)達(dá)到最大，占比為76.23%，隨后有所下降，在第8周時(shí)占比為54.00%，明顯高于CK組的7.33%，表明乳酸乳球菌XP-15能較好地在仿刺參腸道中定殖。夏耘等(2019)在羅非魚(Oreochromisniloticus)的研究中也得到類似結(jié)果，其在飼料中添加1×108CFU/g的乳酸乳球菌，連續(xù)投喂42 d后進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)其中乳酸乳球菌的比例也顯著增加[23]。此外，同步增加的還有不動桿菌屬的細(xì)菌群落，在第8周時(shí)占比為31.95%；而片球菌屬、普雷沃菌屬(Prevotella)等細(xì)菌組成呈現(xiàn)下降趨勢[圖2(a)]。CK組中細(xì)菌組成主要包括有腸球菌屬、雷爾氏菌屬和不動桿菌屬，其中又以腸球菌屬的細(xì)菌占比最高[圖2(b)]。腸球菌屬也是水生生物中常見的益生菌種，周慧慧等從健康仿刺參腸道中分離到腸球菌屬菌株GSC-3，表明其能促進(jìn)仿刺參的生長和提高抗病能力[18]。

圖2 屬水平上實(shí)驗(yàn)組和對照組腸道菌群結(jié)構(gòu)組成Fig. 2 Composition of intestinal flora in experimental (a) and control (b) groups at genus level

2.3 菌株XP-15對仿刺參免腸道疫力的影響

2.3.1 菌株XP-15對仿刺參腸道免疫酶活力的影響 參照文獻(xiàn)[12, 23]對益生菌投喂實(shí)驗(yàn)周期的設(shè)計(jì)，本研究實(shí)驗(yàn)共8周，于第6周測定乳酸乳球菌投喂后仿刺參腸道免疫酶活力的變化，隨后進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)測定免疫保護(hù)率。菌株投喂后的免疫酶活力測定結(jié)果如表2所示，仿刺參腸道的5個(gè)免疫酶活力指標(biāo)中，XP-15組中一氧化氮合成酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶的酶活力值分別為(9.61±0.17) U/mg、(49.80±5.87) U/g、(188.99±4.06) U/mg，均顯著高于CK組(P<0.05)，表明菌株XP-15對仿刺參具有一定的免疫促進(jìn)作用。研究結(jié)果顯示，在仿刺參、烏鱧等水產(chǎn)動物飼料中添加腸球菌、乳球菌等菌株可有效提高酚氧化酶、溶菌酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶等免疫酶活性[18-19]。常杰等(2011)的研究結(jié)果表明，一氧化氮合成酶是機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能被誘導(dǎo)產(chǎn)生NO[24]，NO能夠介導(dǎo)炎癥和免疫系統(tǒng)，從而對病原生物起到抑制作用[25]；溶菌酶是一種堿性酶，能水解致病細(xì)菌中的粘多糖[26]；酸性磷酸酶能夠維持細(xì)胞正常代謝活動，參與消除生物大分子，降解入侵的病原體[27]；而超氧化物歧化酶和過氧化氫酶也是防止自由基形成的重要抗氧化酶[28]。本研究結(jié)果表明，XP-15組的免疫酶活力明顯高于CK組，可能與宿主投喂的XP-15菌株在腸道中定殖，并激活的腸道黏膜免疫有關(guān)[29]。

表2 菌株XP-15對仿刺參腸道免疫酶活力的影響

2.3.2 菌株XP-15對仿刺參抵御病原的影響 研究結(jié)果表明，在飼料中補(bǔ)充益生菌可通過調(diào)節(jié)宿主的細(xì)胞免疫和體液免疫的水平改變宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)，或者增強(qiáng)宿主對入侵病原菌的免疫反應(yīng)，從而增強(qiáng)宿主對入侵病原體的抵抗能力[30-33]。在本研究中，投喂至第6周后，從XP-15組和CK組中隨機(jī)挑選30頭進(jìn)行塔氏弧菌人工感染實(shí)驗(yàn)[2]，結(jié)果表明，CK組在注射后的第2天仿刺參開始出現(xiàn)吐腸、搖頭，吸附力降低，體表潰爛等癥狀，至第7天成活率降至43.33%，至第14天時(shí)成活率為33.33%。XP-15組從第3天開始有個(gè)別仿刺參出現(xiàn)吐腸、體表潰爛等癥狀，至第14天時(shí)成活率為73.33%，顯著高于CK組(P<0.05)，表明投喂菌株XP-15后可以在一定程度上提高仿刺參抵御塔氏弧菌的能力(圖3)，這可能與一氧化氮合成酶、酸性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶等免疫酶活力的高水平表達(dá)有關(guān)[34]。

圖3 XP-15組和CK組投喂后采用塔氏弧菌攻毒感染下仿刺參成活率Fig. 3 Survival rate of sea cucumber infected with V. tubiashii in XP-15 and CK groups

3 結(jié)論

隨著對水產(chǎn)品質(zhì)量安全的關(guān)注度越來越高，水產(chǎn)綠色養(yǎng)殖正在成為行業(yè)發(fā)展方向，替抗產(chǎn)品的開發(fā)也得到越來越多學(xué)者的關(guān)注。本研究表明，經(jīng)連續(xù)8周的投喂，乳酸乳球菌XP-15能夠較好地在仿刺參腸道內(nèi)定殖，在一定程度上提高宿主的生長，并通過提高宿主的非特異性免疫酶活力水平增強(qiáng)抵御病原侵染的能力；研究結(jié)果可以為乳酸乳球菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖特別是仿刺參養(yǎng)殖中的推廣應(yīng)用提供了基礎(chǔ)資料。