林春波，吳 鵬，唐 旭，林錫煌，徐長安

(1.福建農林大學，福建 福州 350002; 2.自然資源部第三海洋研究所, 福建 廈門 361005)

魚肝油主要含有脂溶性維生素A、D3以及DHA、EPA等多種ω-3多不飽和脂類。近年來，越來越多的研究顯示，魚肝油還具有更加廣泛的臨床應用，如抗炎、軟化組織血管、改善情緒和認知功能、降低II型糖尿病風險、保護骨健康、增強生殖系統(tǒng)功能、營養(yǎng)皮膚、降低癌癥風險、保護視力、促進自然減肥等功能[1]。純天然未經深度加工的魚肝油含有其他天然成分和有利于人體吸收的活性物質，能促使人體更好地吸收、利用、代謝天然維生素。

我國魚肝油市場潛力巨大，但目前行業(yè)內還存在一些亟待解決的問題，比較突出的問題就是天然魚肝脂肪油來源緊缺。我國目前所使用的《2015版藥典》規(guī)定魚肝油來源于鮫類動物肝臟。但由于可捕撈的鯊魚種類及數(shù)量日益減少，且多數(shù)屬于保護種，導致可用原料日益萎縮[2]。因此尋找鯊魚肝脂肪油天然替代來源十分重要。

鰩魚是板腮類多種軟骨魚的統(tǒng)稱，屬于鰩形目，主要分鰩科、魟科和鲼科，是鯊魚的近親[3]。近年來，我國鰩魚的捕撈量逐年增加，已經成為主要出口水產品。國內現(xiàn)階段水產加工企業(yè)在加工鰩魚的過程中，會產生高比例的肝臟副產物，其中肝臟占比超過10%[4]，是經濟易得的魚肝油加工原料。但由于脂質成份不明確和技術水平的限制，使得國內企業(yè)在鰩魚肝臟高值化利用領域尚處于空白[5]。另一方面，鰩魚加工副產物富含多不飽和脂肪酸，容易氧化酸敗從而變質。如不及時利用處理，會造成資源浪費、環(huán)境污染[6]。本研究建立了鰩魚肝油的提取及精煉工藝并分析了理化性質、脂肪酸組成，為合理開發(fā)鰩魚加工副產物資源、降低環(huán)境污染、擴充天然魚肝脂肪油來源提供科學依據(jù)[7]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

鰩魚肝由秦皇島市新港水產有限公司提供，置于-20 ℃冰箱凍藏。鯊魚肝油及鱈魚肝油均由國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司提供?；旌现舅峒柞藴势放c單一脂肪酸甲酯標準品，均購于Sigma公司。本實驗所用試劑如氫氧化鈉(NaOH)、磷酸、檸檬酸、活性白土、鹽酸(HCl)、焦性沒食子酸(C6H6O3)、2,6-二叔丁基對甲酚、甲醇(CH3OH, 色譜純)、石油醚、三氟化硼甲醇溶液(濃度14%)、正己烷(色譜純)、無水硫酸鈉等，除另有說明，均為國產分析純，購于廈門市綠茵試劑玻儀有限公司。

1.2 主要儀器和設備

GCMS-QP2010型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(SHIMADZU，日本島津)，分析天平[精確度0.000 1 g，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]，N-1100型旋轉蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，TG16-WS型離心機(長沙維爾康湘鷹離心機有限公司)，KQ-300E型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)，JMLB-50型膠體磨(上?？苿跈C械設備有限公司)，DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗鰩魚肝油的提取 粗魚油提取工藝在實際生產中常用堿法和酶法。堿法工藝簡單、提取率較高，但廢液處理會增加成本且造成環(huán)境污染。酶法提取條件溫和，但蛋白酶添加量高，一般添加量在原料的2%(質量分數(shù))以上[8-9]，且需加入較多NaOH來調節(jié)pH，在分離魚油時也存在油水兩相乳化的問題，酶解后廢料內蛋白質含量很低，無法作為飼料添加劑再利用。除此之外，酶解法還會使魚肝油帶有異味，為后期除臭增加工作量[10]。本研究探索了一種新方法，利用“冷凍-解凍”的方法提取粗油，即利用凍結、解凍加之物理粉碎，同時超聲輔助提取的方法，原理是利用溫度場的循環(huán)變化使乳狀液中的油水兩相發(fā)生反復相變，破壞其乳狀的液體系，從而使得油脂從乳狀液中分離出來。此方法與上述堿法和酶法相比，無任何添加物，既降低成本，又無多余雜質殘留，也無多余反應，不會造成環(huán)境污染。

理論魚肝油含量為鰩魚肝臟的粗脂肪含量，利用索氏提取法進行測定。精密稱取5～10 g鰩魚肝,研細，全部移入濾紙筒內。將濾紙筒放入脂肪萃取器的樣品室內，連接已干燥至恒重的收集瓶，從萃取器冷凝管上端加入無水乙醚或石油醚至瓶內容積的2/3處，水浴加熱，使乙醚或石油醚不斷回流提取6～12 h。取下收集瓶，回收乙醚或石油醚，待收集瓶內乙醚剩1～2 mL時水浴蒸干，再于95～105 ℃干燥20 min，放干燥器內冷卻0.5 h后稱量M總。理論魚肝油含量=[(M總-M瓶)/M樣]×100%。

取-18 ℃凍藏的鰩魚肝1 kg，以超聲輔助自然解凍，用膠體磨粉碎后裝入離心瓶后放入超聲鍋，在40 kHz下超聲處理2 h，目的是利用超聲的功率特性和空化作用，加速水油分離；靜置12 h后將其置于大容量離心機中，在轉速10 000 r/min、25 ℃下離心10 min，分離得上層粗魚肝油，計算提取率。粗魚肝油提取率=(提取的粗魚肝油質量/理論魚肝油質量)×100%。

1.2.2 粗鰩魚肝油精煉 ①脫膠。準確稱取100 g粗鰩魚肝油于錐形瓶內，加入5 g配制好的脫膠劑(85%磷酸和40%檸檬酸, 體積比為1.5∶1.0)，50 ℃水浴加熱攪拌30 min后，10 000 r/min離心10 min (24 ℃)[11]，將上層脫膠魚肝油移置干凈錐形瓶內。稱量并計算提取率。

②脫酸。以NaOH添加量(以油重的百分比計，下同)、加熱時間、加熱溫度為主要影響因素，魚肝油提取率(%)為評價指標，采用3因素1水平響應面法對魚肝油脫酸工藝進行優(yōu)化。為了綜合多指標考察魚肝油脫酸工藝，首先對魚肝油脫酸工藝影響較大的單因素(NaOH添加量、加熱時間、加熱溫度)進行考察，確定優(yōu)化范圍。將脫膠魚肝油準確稱量于干凈錐形瓶內，在其他處理條件一致的情況下，分別設置合適的NaOH添加量、加熱時間、加熱溫度，以脫酸魚肝油提取率為指標[12]，考察其對魚肝油脫酸效果的影響。

③脫色。將脫酸魚肝油準確稱量于干凈錐形瓶內，加入一定量的活性白土在70 ℃下脫色20 min，然后10 000 r/min、24 ℃下離心10 min，獲得上層清油，即脫色魚肝油。稱量并計錄數(shù)據(jù)。

④脫臭。將脫膠魚肝油準確稱量于干凈蒸餾瓶內，40 ℃，60 r/min下減壓蒸餾不等時間進行脫臭處理[13]，獲得脫臭魚肝油。稱量并計錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 理化指標的檢測 水分及揮發(fā)物含量按照《動植物油脂水分及揮發(fā)物的測定》[14]中電熱干燥箱法測定。酸值按照《食品中酸價的測定》[15]中冷溶劑指示劑滴定法測定。碘值按照《動植物油脂碘值的測定》[16]中的方法測定。過氧化值按照《食品中過氧化值的測定》[17]中的滴定法測定。不皂化物按照《動植物油脂不皂化物測定》[18]中己烷提取法測定。

1.2.4 脂肪酸組成分析 ①樣品前處理。取0.08 g魚肝油于15 mL離心管中，加入2 mL0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液，在65 ℃下皂化30 min，然后冷卻至室溫。加入20滴0.5 mol/L的HCl調節(jié)pH，使pH小于2，再加入4 mL的BF3·MeOH溶液，煮沸3 min，進行甲酯化[19]。冷卻至室溫后加入4 mL飽和NaCl溶液，用2 mL正己烷萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，用0.22 μm的有機濾膜過濾所得樣品后，使用GC-MS測定脂肪酸相對含量[20]。

②氣相色譜條件。色譜柱：Rtx-5MS (60 m×0.25 mm， 0.25 μm)；載氣：高純 He；分流進樣；進樣量1 μL；檢測溫度：280 ℃；程序升溫：起始柱溫設定為60 ℃[21]，以15 ℃/min升至160 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min；最后以5 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

2 結果與討論

2.1 鰩魚肝油精煉工藝參數(shù)的確定

2.1.1 粗鰩魚脂肪油提取 凍融法的原理是利用溫度場的循環(huán)變化，使魚肝油中的油水兩相發(fā)生反復相變，破壞其乳化體系，從魚肝中分離出油脂。本研究利用凍融法得到的粗油，既無任何添加物，又無多余雜質殘留，且提取率(表1)高于臧麗芹等(2013)利用酶解法得到的粗油的提取率(86%)[22]，具有極大的應用價值。

表1 凍融法提取粗鰩魚肝油的提取率

2.1.2 脫酸工藝參數(shù)確定 粗鰩魚肝油的脫酸主要是游離脂肪酸與足量的NaOH發(fā)生中和反應，使游離脂肪酸皂化[23]。為了降低精煉油的顏色和確保去除痕量成分，須向體系中加入過量NaOH，通過離心和水洗可去除皂和磷脂。實驗發(fā)現(xiàn)NaOH的添加量是影響脫酸效果的主要原因，溫度及加熱時間也有一定影響。為確定最優(yōu)工藝，分別考察了NaOH添加量、加熱溫度及加熱時間3個因素對脫酸提取率和酸值的影響。單因素實驗結果及酸值測定結果詳見圖1。

圖1 各因素對提取率及酸值的影響Fig. 1 Influences of different factors on extraction yield and acid value根據(jù)標準《魚油》[24]可知，對于精制魚油，酸值≤1為一級魚油，酸值≤3為二級魚油。

①NaOH添加量的影響。固定加熱溫度為85 ℃、加熱時間為20 min，考察不同NaOH添加量對脫酸魚肝油提取率和酸值的影響。準確稱量40 g脫膠魚油，分別加入8、10、12、14 g NaOH進行脫酸。實驗結果如圖1(a)所示，魚肝油提取率隨著NaOH添加量的增加呈現(xiàn)下降的趨勢，下降趨勢為一個百分點左右，表明NaOH添加量對提取率的影響較大。酸值隨著NaOH添加量的增加也呈現(xiàn)下降趨勢。

②加熱溫度的影響。固定NaOH添加量為20.0%、加熱時間為20 min，考察不同加熱溫度對脫酸魚肝油提取率和酸值的影響。準確稱量40 g脫膠魚油，分別在65、70、75、80、85 ℃下進行脫酸。實驗結果如圖1(b)所示，魚肝油提取率隨著溫度的升高呈現(xiàn)極小的下降趨勢，表明加熱溫度對提取率影響不大。酸值隨著溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢。

③加熱時間的影響。固定加熱溫度為85 ℃、NaOH添加量為20.0%，考察不同加熱時間對脫酸魚肝油提取率和酸值的影響。準確稱量40 g脫膠魚油，分別加熱15、20、25、30 min進行脫酸。實驗結果如圖1(c)所示，魚肝油提取率隨著加熱時間增加呈現(xiàn)下降趨勢，但變化極小，表明加熱時間對提取率的影響也較小。酸值隨著加熱時間增加也呈現(xiàn)下降趨勢。

④響應面實驗方案設計。在單因素考察的基礎上，以加熱溫度(℃，A)、加熱時間(min，B)、NaOH添加量(%，C)3個因素作自變量，以脫酸魚肝油提取率(%，Y)作因變量，采用響應面法優(yōu)化最佳提取工藝。實驗設計如表2，共17組，每組分別稱取脫膠魚肝油約36 g，實驗結束后稱量計算提取率。

表2 脫酸魚肝油提取率響應面實驗數(shù)據(jù)

⑤模型擬合和提取工藝優(yōu)化。采用Design-Expert 8.0.6對魚肝油脫酸工藝實驗結果進行多元回歸擬合。經過運算后得到魚肝油脫酸提取率(%，Y)、對加熱溫度(℃，A)、加熱時間(min，B)、NaOH添加量(%，C)的模型，其擬合回歸模擬方程如下，其回歸模型的方差分析見表3。Y(提取率)=0.94-7.639×10-3A-8.736×10-3B-0.030C+9.395×10-5A·B+9.197×10-4A·C-1.878×10-3B·C-9.772×10-4A2+1.596×10-3B2+0.013C2。

表3 回歸模型的方差分析結果

圖2顯示了各因素對魚肝油提取率交互作用的響應面實驗結果。根據(jù)圖2(a)可知，升高溫度對提取率影響不明顯，且加熱時間與加熱溫度相互作用不緊密，因此二者相互不顯著。圖2(b)中，升高溫度對提取率影響不明顯，但NaOH添加量對提取率的影響較大。同時可見二者具有一定的相互作用。由圖2(c)可知，延長加熱時間對提取率影響不明顯，但NaOH添加量對提取率的影響很大，且二者具有一定的相互作用。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對上述實驗結果進行優(yōu)化，以Y最大化為原則，得到優(yōu)化的最佳脫酸工藝條件為：NaOH添加量為20.0%(質量分數(shù))，溫度為69.78 ℃，時間為15.72 min。但結合實際操作的可行性，同時考慮到酸值不僅需要滿足一級魚油標準，也需使游離脂肪酸盡可能去除，由單因素實驗可以得出，加熱溫度為75 ℃時游離脂肪酸基本被完全去除，故確定最優(yōu)工藝條件為：NaOH添加量20.0%(質量分數(shù))，加熱溫度75 ℃，加熱時間20 min，預測提取率為70.16%。用以上條件參數(shù)進行平行實驗3次，平均提取率為70.08%，相對誤差值為0.11%。

2.1.3 脫色工藝參數(shù)的確定 脫色過程是破壞或吸附一級氧化產物，色素和痕量的金屬離子均可以使用活性白土加以去除[25]?；钚园淄撂砑恿?以油重的百分比計，下同)是影響脫色效果的重要原因，因此本研究重點考察了活性白土不同添加量對魚肝油的脫色效果、損失率及提取率的影響，從而確定脫色工藝參數(shù)，詳見表4。

表4 活性白土添加量對顏色、損失率及提取率的影響

圖2 各因素對鰩魚肝油提取率交互作用的響應面圖Fig. 2 Response surface diagram of the interaction of various factors on the extraction yield of skate liver oil

由表4可知，當活性白土添加量為6%與5%時，得到的脫色魚油較渾濁；當活性白土添加量為10%與8%時，得到的脫色魚油均為澄清。隨活性白土添加量的增多，損失率增加。再結合表1，發(fā)現(xiàn)活性白土添加量為8%時的損失率低且提取率較高，故確定脫色最佳工藝參數(shù)為活性白土添加量為8%。

2.1.3 脫臭工藝參數(shù)的確定 脫臭主要是在高真空條件下，經過蒸餾去除油中微量的脂肪酸、醛類、酮類和其他揮發(fā)性化合物，得到口感及氣味溫和的油[26]。根據(jù)文獻資料，本研究固定蒸餾溫度為40 ℃，主要考察蒸餾時間對脫臭的影響，詳見表5。

表5 蒸餾時間對顏色、氣味及提取率的影響

由表5可知，當蒸餾時間為20 min及30 min時，雖提取率高，但腥臭味較大，當蒸餾時間為60 min時，提取率較高且腥臭味很小，故確定脫臭最佳工藝參數(shù)為在40 ℃、60 r/min下減壓蒸餾60 min。

2.2 精煉鰩魚肝脂肪油的理化性質

常規(guī)生產魚肝油過程中得到的粗魚肝油含有不同量的非甘油酯共存成分(如蛋白質、磷脂、色素等)[27]。這些雜質通過脫膠、脫酸、脫色、脫臭等精煉工藝進行脫除，得到酸值、過氧化值等理化指標合格的精制魚肝油(表6)。

表6 精制鰩魚肝油的理化性質及與標準的比較

由表6可知，精煉后的鰩魚肝油的理化性質均滿足一級魚油標準，其中不溶性雜質、不皂化物、酸值、過氧化值以及茴香胺值均遠遠優(yōu)于一級魚油標準的質量要求。由此可知，本研究所采用的精煉方法能獲得品質較高的魚肝油，獲得的精煉魚肝油顏色為金黃、澄清，略有魚腥味。

2.3 不同來源天然魚肝油的脂肪酸組成分析

魚肝油功能多樣歸因于其豐富的活性物質。脂肪酸是魚肝油的主要功能成分，各種動植物油脂中脂肪酸組成及含量均存在較明顯的差異，尤其是特征脂肪酸更是如此[28]。確定不同來源的天然魚肝油脂肪酸組成及其相對含量，能為擴大天然魚肝油來源種類提供理論依據(jù)。圖3為鱈魚肝油、鯊魚肝油、精制鰩魚肝油、粗鰩魚肝油的脂肪酸組成圖譜。對照標準品的目標離子、參考離子以及保留時間進行逐個定性，再利用面積歸一法計算每種脂肪酸的相對含量，結果如表7所示。

圖3 四種魚肝油脂肪酸組成圖譜Fig. 3 Fatty acid composition map of four fish liver oils

表7 四種魚肝油的脂肪酸組成分析

續(xù)表

由表7可知，幾種魚肝油均含有C14～C22脂肪酸23種，其中有飽和脂肪酸5種，單不飽和脂肪酸7種，多不飽和脂肪酸11種。對比粗鰩魚肝油與精制鰩魚肝油的脂肪酸成分，發(fā)現(xiàn)粗鰩魚肝油的不飽和脂肪酸占88.24%，其中多不飽和脂肪酸占45.10%。較為重要的多不飽和脂肪酸EPA和DHA的含量也較高，分別為10.17%與13.61%。精制鰩魚肝油的脂肪酸組成變化不大，不飽和脂肪酸占87.62%，其中多不飽和脂肪酸占44.48%。EPA和DHA的含量也基本無改變，分別為8.65%與15.04%。這說明鰩魚肝油精煉過程對其脂肪酸組成影響較小。

對比鱈魚肝油、鯊魚肝油以及精制和粗鰩魚肝油的脂肪酸組成數(shù)據(jù)(表7)，鱈魚肝油中DHA和EPA含量分別為11.09%和8.78%，鯊魚肝油中DHA和EPA含量分別為12.10%和2.74%，由此可知，本工藝生產的鰩魚肝油中的EPA含量及DHA含量均較高。

2.4 討論

采用凍融法提取鰩魚肝粗油與臧麗芹等利用酶解法提取鰩魚肝油[22]相比，凍融法無任何添加物，成本低，無多余反應，無雜質殘留，且提取率高達90%，高于酶解法的86%，具有極大的應用價值。由脫酸實驗可知酸值在某些特定條件下變化較大：當改變NaOH添加量時，加入的堿與游離脂肪酸反應,隨著NaOH添加量的增加，油脂中的游離脂肪酸更多地被清除，從而導致酸值降低。加熱溫度由75 ℃變?yōu)?0 ℃時酸值下降最為明顯，其中的原因可能是隨溫度上升，分子運動加速，分子間的碰撞幾率增加[5]。溫度繼續(xù)升高，變化不大，由此可推測在75～80 ℃之間堿煉反應速度達到最佳，使油脂中的游離脂肪酸在相同時間內被較多地清除。加熱時間延長一倍，對酸值的影響在1.0～1.5倍之間，其原因可能是隨著加熱時間的增加，加入的堿與魚肝油中游離脂肪酸進一步反應，導致酸值降低。而在25～30 min酸值變化極小，可能是魚肝油中游離脂肪酸基本已反應完全。對精煉鰩魚肝油進行檢測分析，同時與粗鰩魚肝油、鱈魚肝油以及鯊魚肝油進行對比，發(fā)現(xiàn)精煉后的鰩魚肝油呈澄清、金黃色，稍有魚腥味，各項理化指標均達到了一級魚油標準；精煉前后脂肪酸組成基本沒有太大變化，DHA與EPA含量均較高。但市售鱈魚肝油與鯊魚肝油顏色會更淺一些，因此在鰩魚肝油脫色方面還需要進一步研究。

3 結論

本研究采用凍融法提取鰩魚肝粗油，無添加物，無雜質殘留，提取率達到90%，遠高于酶解法。通過響應面實驗獲得鰩魚肝油精煉工藝的最佳參數(shù)，用5%(質量分數(shù))的脫膠劑脫膠(40%檸檬酸與85%磷酸按體積比1.0∶1.5混合)，用20%(質量分數(shù))NaOH脫酸(75 ℃，20 min)，用8%(質量分數(shù))的活性白土脫色，在40 ℃、60 r/min條件下減壓蒸餾60 min脫臭。在此條件下精煉，脂肪酸組成變化十分不明顯，精煉后的鰩魚肝油呈澄清、金黃色，稍有魚腥味，各項理化指標均達到了一級魚油標準。同時對精制鰩魚肝油進行了脂肪酸成分分析，得到精制鰩魚肝油含有C14～C22脂肪酸23種，其中飽和脂肪酸7種，單不飽和脂肪酸5種，多不飽和脂肪酸11種；飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸分別占脂肪酸總量的12.39%和87.61%；飽和脂肪酸主要是C14:0(豆蔻酸)與C18:0(棕櫚酸)，分別占脂肪酸總量的6.42%和4.47%；單不飽和脂肪酸主要是C16:1-9c與C18:1-9c，分別占脂肪酸總量的7.38%和10.84%；多不飽和脂肪多烯酸主要是C20:5(EPA)與C22:6(DHA)，分別占脂肪酸總量的8.65%和15.04%。與市售鱈魚肝油及鯊魚肝油對比，脂肪酸種類相同且含量相差不大，但主要脂肪酸DHA及EPA含量更高，可為擴大天然魚肝油來源提供科學依據(jù)。