宏蘋蘋，李濤，歐建平

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 510630)

卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)是一種用于治療不孕特別是嚴(yán)重男性因素所致不孕的輔助生殖技術(shù)，其過程是利用顯微操作技術(shù)將單個(gè)精子注射到卵母細(xì)胞的細(xì)胞漿中，使其受精，培養(yǎng)成胚胎，再植入女方宮腔內(nèi)，從而達(dá)到妊娠目的。卵母細(xì)胞質(zhì)量是受精和胚胎發(fā)育的重要因素之一[1-2]。卵母細(xì)胞在受精前暴露于體內(nèi)和體外環(huán)境的時(shí)間對于獲得高質(zhì)量的卵母細(xì)胞和胚胎可能具有至關(guān)重要的意義。Rienzi等[3]研究了卵母細(xì)胞不同預(yù)孵育期與ICSI結(jié)果之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ICSI前至少3 h的預(yù)孵育期可以提高胚胎質(zhì)量。其他研究表明，在ICSI前進(jìn)行卵母細(xì)胞預(yù)孵育與卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎質(zhì)量的提高有關(guān)[4-5]。但也有研究認(rèn)為，在顆粒細(xì)胞剝離之前延長卵母細(xì)胞孵育時(shí)間對受精或ICSI結(jié)局沒有影響[6-9]。

有研究結(jié)果顯示，注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)后36 h取卵，可以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，從而改善胚胎和妊娠結(jié)局，是影響ICSI妊娠率最為重要的因素[10-11]。如果HCG作用時(shí)間不夠，即使推遲剝離顆粒細(xì)胞及注射精子，也無法彌補(bǔ)卵母細(xì)胞在卵泡微環(huán)境中暴露時(shí)間不足的缺陷。迄今為止，取卵后到ICSI注射的最適時(shí)間仍有爭議。黃國寧等[12]指出ICSI注射應(yīng)安排在取卵后2～4 h進(jìn)行，而Dozortsev等[13]的研究得出ICSI注射的最佳時(shí)間是HCG后37～41 h的結(jié)論。Kilani等[14]發(fā)現(xiàn)，多數(shù)MⅡ期卵母細(xì)胞在HCG后39～40.5 h可以觀察到紡錘體且有最高的阻滯值，因此HCG后39～40.5 h可能是ICSI的最佳時(shí)間。

基于輔助生殖胚胎實(shí)驗(yàn)室的日常工作安排，本中心的ICSI注射一般為取卵后4 h以上，特殊情況可提前至取卵后2～4 h，但臨床上關(guān)于不同的取卵與ICSI注射時(shí)間間隔(OPU-ICSI時(shí)間間隔)是否會(huì)影響ICSI周期結(jié)局還有爭議。因此，本研究旨在探討本中心不同OPU-ICSI時(shí)間間隔行ICSI的周期結(jié)局，以期更好地優(yōu)化周期管理和工作流程。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2015年9月至2020年5月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心因男性因素不孕而接受ICSI周期治療患者的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)無精子癥患者及冷凍精液周期；(2)未獲卵周期；(3)無可利用胚胎周期；(4)未移植周期。

本研究共納入1 205例患者的1 205個(gè)新鮮移植或凍融胚胎移植(FET)周期。根據(jù)OPU-ICSI時(shí)間間隔不同，將患者分為A組(間隔2～4 h，362例)和B組(間隔>4 h，843例)。

二、研究方法

1.促排卵方案：主要采用黃體期長方案或拮抗劑方案。以超聲檢查、血尿黃體生成素(LH)峰值測定等方法綜合監(jiān)測卵泡的生長發(fā)育。并根據(jù)卵巢反應(yīng)調(diào)整促性腺激素(Gn)的劑量，當(dāng)超聲下觀察到雙側(cè)卵巢至少有1個(gè)卵泡直徑達(dá)18 mm時(shí)，肌肉注射HCG 6 000～10 000 U，36 h后在陰道超聲引導(dǎo)下取卵。

2.體外授精：獲得的卵母細(xì)胞沖洗干凈后，置于含10%人血清白蛋白(HSA)的G-IVF(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液中，覆蓋礦物油(Vitrolife，瑞典)，放置于37℃、6%CO2、5%O2和89%N2環(huán)境的三氣培養(yǎng)箱(COOK，美國)中培養(yǎng)，直至去除顆粒細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室工作安排，在取卵后一定時(shí)間將卵母細(xì)胞置于透明質(zhì)酸酶(SAGE，丹麥)中消化去除顆粒細(xì)胞后進(jìn)行ICSI注射。注射后將卵母細(xì)胞洗凈，置于含5%HSA的G-1(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。精液處理采用密度梯度離心法。

3.胚胎培養(yǎng)：ICSI注射后16～18 h觀察受精情況，評估胚胎的正常受精率(2PN受精率)、異常受精率和ICSI退化率(ICSI卵母細(xì)胞退化指卵母細(xì)胞在ICSI注射后或者第2天觀察受精時(shí)發(fā)生凋亡；ICSI退化率=ICSI退化卵母細(xì)胞數(shù)/注射MⅡ卵總數(shù)×100%)。將正常受精的胚胎置于含5%HSA的G-1微滴中培養(yǎng)至第3天，根據(jù)胚胎卵裂球數(shù)目、卵裂球均一性及碎片程度對胚胎質(zhì)量進(jìn)行評估。經(jīng)患者知情同意后選擇移植或冷凍或者在含5%HSA的G-2(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚。囊胚質(zhì)量評估采用Gardner評分法[15]。

4.胚胎冷凍和解凍：胚胎冷凍使用開放式玻璃化冷凍系統(tǒng)(Kitazato，日本)；解凍使用玻璃化解凍試劑盒(Kitazato，日本)，解凍后胚胎放置于含5%HSA的G-2培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 h后再移植。

5.胚胎移植和妊娠判斷：本研究納入患者的首次移植資料，即取卵周期的首次新鮮移植或者取卵周期全胚冷凍后的首次FET。選擇評分最高的1～2枚卵裂期胚胎或囊胚在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行胚胎移植。臨床妊娠定義為胚胎移植后6～7周經(jīng)超聲檢查出現(xiàn)至少1個(gè)孕囊(包括異位妊娠)及胎心搏動(dòng)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者基本情況

本研究共納入1 205例患者，其中A組362例，B組843例。兩組患者的平均年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、Gn用量、扳機(jī)日E2水平、注射HCG與取卵時(shí)間間隔(HCG-OPU時(shí)間間隔)及不同卵巢刺激方案占比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的基本資料比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和臨床結(jié)局比較

兩組患者的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)如獲卵數(shù)、卵子成熟率、受精率、2PN受精率、異常受精率、ICSI退化率、優(yōu)胚率、移植胚胎類型、平均移植胚胎數(shù)等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。兩組間的臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、新生兒平均出生孕周及出生體重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較[(-±s)，M(P25，P75)，n(%)]

表3 兩組患者的臨床結(jié)局比較[(-±s)， n(%)]

三、Pearson相關(guān)性分析結(jié)果

OPU-ICSI時(shí)間間隔與主要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析顯示，OPU-ICSI時(shí)間間隔與卵子成熟率(P=0.099)、2PN受精率(P=0.497)和優(yōu)胚率(P=0.910)均無顯著相關(guān)性(表4)。

四、二元Logistic回歸分析結(jié)果

將可能影響臨床妊娠率的各種因素，包括女方年齡、扳機(jī)日E2水平及OPU-ICSI時(shí)間間隔等納入Logistic回歸分析，調(diào)整混雜因素后發(fā)現(xiàn)，在1 205例患者中，女方年齡、獲卵總數(shù)、2PN受精率、優(yōu)胚率能顯著影響臨床妊娠率(P<0.05)，而OPU-ICSI時(shí)間間隔、HCG-OPU時(shí)間間隔等因素并不顯著影響臨床妊娠率(P>0.05)(表5)。

表5 臨床妊娠率影響因素的二元Logistic回歸分析

討 論

獲得高質(zhì)量的成熟卵母細(xì)胞是輔助生殖治療中的關(guān)鍵因素之一。在卵泡生長的最后階段存在一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，包括結(jié)構(gòu)、分子和生化修飾，稱為卵母細(xì)胞成熟。在此過程中，卵母細(xì)胞周圍顆粒細(xì)胞的連接蛋白和縫隙連接的表達(dá)與卵母細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)成熟有關(guān)[16-18]。HCG-OPU時(shí)間間隔是卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟的關(guān)鍵[19]。研究證實(shí)，適當(dāng)延長體內(nèi)成熟時(shí)間，即HCG-OPU時(shí)間間隔>36 h，有助于促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，從而改善胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局[10-11]。在本研究中，按照OPU-ICSI時(shí)間間隔不同分為間隔2～4 h組(A組)和>4 h組(B組)，兩組的HCG-OPU時(shí)間間隔均>36 h，B組的卵子成熟率略高于A組，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

有研究表明，在ICSI周期中，卵母細(xì)胞取出到ICSI注射之間的預(yù)孵育期可提高卵母細(xì)胞成熟率、受精率和胚胎質(zhì)量[3-5，13，20]。因?yàn)槁涯讣?xì)胞在ICSI注射前的孵育可誘導(dǎo)胞漿成熟，使卵母細(xì)胞獲得充分激活，從而提高受精率和妊娠率。在本研究中，B組的卵子成熟率和受精率略大于A組，2PN受精率和優(yōu)胚率略低于A組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果也表明，OPU-ICSI時(shí)間間隔與卵子成熟率、2PN受精率及優(yōu)胚率無顯著性相關(guān)(P>0.05)。還有研究表明，受精率提高的原因不僅與細(xì)胞質(zhì)的進(jìn)一步成熟有關(guān)，還與卵母細(xì)胞的老化有關(guān)[9，21]。第二次減數(shù)分裂有兩個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子：M期啟動(dòng)子(MPF)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，二者隨著卵母細(xì)胞的老化活性降低，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞的自發(fā)激活[22-23]。因此，MPF水平較低的老化卵母細(xì)胞更有可能被ICSI激活形成原核，從而解釋了受精率隨著OPU-ICSI時(shí)間間隔延長而增加的原因，但老化的卵母細(xì)胞中，異常受精也可能增加[24]。另外，一些研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞剝除前孵育2～4 h可以提高優(yōu)質(zhì)胚胎率[5，25]；但孵育時(shí)間越長，優(yōu)質(zhì)胚胎率就越低[23]。潛在的原因可能是因?yàn)轭w粒細(xì)胞能促進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)的進(jìn)一步成熟，有利于隨后的胚胎發(fā)育[26-27]。

Pujol等[9]的一項(xiàng)回顧性試驗(yàn)提出，OPU-ICSI時(shí)間間隔每增加1 h，臨床妊娠率下降7.7%。也有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞在ICSI注射前孵育4或6 h的妊娠率相似或增加，但超過6 h后妊娠率顯著下降[22，28]。這可能是由于卵母細(xì)胞在剝除顆粒細(xì)胞前孵育一段時(shí)間達(dá)到了受精的最佳狀態(tài)，但過度孵育會(huì)導(dǎo)致超微結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的改變，增加紡錘體異常的發(fā)生率，從而影響胚胎的發(fā)育潛能[29-30]。但也有研究表明，OPU-ICSI時(shí)間間隔不影響ICSI的受精和妊娠結(jié)局[6-9]。Garor等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，延遲卵母細(xì)胞剝離或ICSI注射并沒有增加受精或妊娠率，本研究結(jié)果與之相似。本研究中兩組間的臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及新生兒出生結(jié)局均無顯著性差異(P>0.05)，并且對影響臨床妊娠率的因素進(jìn)行了回歸分析，校正混雜因素后發(fā)現(xiàn)女方年齡、獲卵總數(shù)、2PN受精率和優(yōu)胚率能顯著影響臨床妊娠率(P<0.05)，而OPU-ICSI時(shí)間間隔等與臨床妊娠率沒有顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)。如今ICSI的最佳注射時(shí)間仍無定論，本中心在參考國內(nèi)外共識、相關(guān)論著及自身工作安排等基礎(chǔ)上，將ICSI注射時(shí)間定為取卵后大于4 h，特殊情況如法定節(jié)假日等為了不延長工作時(shí)間可調(diào)整在取卵后2～4 h行ICSI注射。本研究的結(jié)果顯示，不同的OPU-ICSI時(shí)間間隔并不會(huì)對患者的妊娠結(jié)局造成明顯的負(fù)面影響，這有助于胚胎實(shí)驗(yàn)室工作人員有效地安排工作，提高實(shí)驗(yàn)室工作效率。

綜上，OPU-ICSI時(shí)間間隔與臨床妊娠率沒有顯著關(guān)聯(lián)，在不影響ICSI周期妊娠結(jié)局的情況下，靈活地安排ICSI時(shí)間，可以優(yōu)化周期管理和工作流程，以適應(yīng)輔助生殖治療日益增長的需求。