王亞月，董超群，靳志遠(yuǎn)，張萌萌，裴冬麗

(商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院，河南 商丘 476000)

含鹵有機(jī)物在醫(yī)學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用，被廣泛用于除草劑、殺蟲劑、抗生素、藥品、塑料制品及有機(jī)合成中間體，然而由于這類化合物的不當(dāng)使用，導(dǎo)致有機(jī)鹵化物在環(huán)境中積累.由于很多鹵代物具有“致癌、致畸、致突變”效應(yīng)[1]，其在用于生產(chǎn)活動的同時(shí)給環(huán)境和人類帶來嚴(yán)重的危害.因此，對有機(jī)鹵代物脫鹵的研究具有重要意義.

微生物作為自然界中主要分解者，將復(fù)雜的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為簡單的化合物，從而保持生命元素的循環(huán)往復(fù).生長在被有機(jī)鹵代物污染的環(huán)境中的微生物具有轉(zhuǎn)化這些化合物的能力，即其細(xì)胞內(nèi)存在催化脫鹵作用的酶，這類酶被稱為脫鹵酶.DL-2-鹵代酸脫鹵酶(2-haloacid dehalogenase)j 催化裂解鹵代酸中碳-鹵鍵斷裂的一類酶，使之脫去鹵素原子，并產(chǎn)生所對應(yīng)的2-羥基羧酸化合物[2].2-鹵代酸脫鹵酶具有反應(yīng)底物廣譜性和高效的立體選擇性，并且在催化水解反應(yīng)中無需添加還原劑，因而在環(huán)境修復(fù)與化工合成領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用價(jià)值.如可制備手性羥基酸與鹵代酸，用作農(nóng)藥、醫(yī)藥及化工合成的中間體[3-6].

目前已報(bào)道的DL-2-鹵代酸脫鹵酶相對較少，包括分離自Pseudomonassp.113的DL-DEX 113，PseudomonasputidaPP3的DehI與Methylobacteriumsp.CPA1的DL-DEX Mb[7-9].天然酶的表達(dá)量通常很低，從而限制了改酶的應(yīng)用及深入研究.本研究以分離自P.putidaPP3 菌株的DL-2-鹵代酸脫鹵酶DehI為研究對象，通過將構(gòu)建成功的DehI-pET28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EscherichiacoliBL21(DE3)，進(jìn)行原核表達(dá)，為獲得較多可溶性表達(dá)蛋白，并對其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化.以為進(jìn)一步研究改酶的對映體選擇性機(jī)制和改造奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

DehI-pET28a重組質(zhì)粒，E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞.

1.1.2 主要試劑

氯化鈣(Sigma-aldrich，Germany )，異丙基硫代半乳糖苷IPTG(Takara，北京)，卡那霉素(上海生工)，L-2-氯丙酸(上海梯希愛)，丙烯酰胺(上海生工)，甲叉-雙丙烯酰胺(上海生工).

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L(用1 mol/L的NaOH調(diào)至pH=7.5，121 ℃，滅菌20 min)；LB固體培養(yǎng)基則是在上述基礎(chǔ)上加入18 g/L瓊脂.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建DehI原核表達(dá)載體

將前期構(gòu)建成功的DehI-pET28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞.

1.2.2 DehI表達(dá)條件優(yōu)化

表1 DehI表達(dá)條件優(yōu)化

續(xù)表1

如表1，分別從IPTG濃度，IPTG加入時(shí)間，IPTG誘導(dǎo)時(shí)間與誘導(dǎo)溫度4個(gè)因素方面進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置因素水平，IPTG濃度分別為0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.5 mmol/L，0.7 mmol/L與1 mmol/L；IPTG加入時(shí)間分別是OD600 nm為0.3，0.5，0.6，0.8，0.9，1時(shí)加入；IPTG誘導(dǎo)時(shí)間分別為3 h，5 h，7 h，9 h與12 h；誘導(dǎo)溫度分別為15 ℃，20 ℃，25 ℃，30 ℃與37 ℃.基于隨機(jī)區(qū)組理論基礎(chǔ)，使用Design-expert軟件對DehI誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行組合，共獲得30個(gè)誘導(dǎo)條件組合(表1).

取活化的重組菌株菌液0.5 mL轉(zhuǎn)移至50 mL含50 μg/mL 卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至表1中每個(gè)誘導(dǎo)組對應(yīng)OD600nm，調(diào)至轉(zhuǎn)速為180 r/min，并置于表1中相應(yīng)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).誘導(dǎo)結(jié)束后，于8000 r/min，4 ℃，離心30 min收集菌體，-80 ℃凍存?zhèn)溆?

1.2.3 粗酶液制備

取凍存的菌體，重懸于5 mL預(yù)冷的裂解緩沖液(50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH=8.0)中，冰浴條件下超聲破碎(200 W，工作2 s，間隙2 s,120循環(huán)).12000 r/min，4 ℃，離心30 min，收集上清，即為粗酶液.

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

通過 SDS-PAGE 方法鑒定不同組合條件下蛋白表達(dá)情況[10].取粗酶液45 μL，加入5 μL上樣緩沖液，混勻，煮沸10 min，運(yùn)用12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳，結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)G-250染液染色，經(jīng)脫色后，觀察蛋白條帶顏色深淺判斷DehI表達(dá)水平.

1.2.5 酶活性分析

反應(yīng)體系1 mL，包括：10 mmol/L L-2-氯丙酸，100 mmol/L，pH10甘氨酸-NaOH，200μL待測酶液，在30 ℃水浴中反應(yīng)30 min，加入1%(v/v)的濃磷酸(85% w/w)終止反應(yīng).12000 r/min，離心10 min去除沉淀.通過HPLC檢測氯丙酸的減少確定酶活性[11].酶活單位(U)定義為:每分鐘催化轉(zhuǎn)化1 μmol 氯丙酸所需要的酶量.

注:M,純化的DehI蛋白.圖1 誘導(dǎo)組合1-17條件下重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物 SDS-PAGE圖

注:M,純化的DehI蛋白.圖2 誘導(dǎo)組合18-30條件下重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE圖

2 結(jié)果與分析

2.1 DehI表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

通過SDS-PAGE檢測不同誘導(dǎo)條件組合下蛋白表達(dá)量.如圖1和圖2所示，不同誘導(dǎo)組合條件下均獲得可溶性表達(dá)，蛋白表達(dá)量不盡相同.誘導(dǎo)組合3，7，8，9，12，15，16，20，21，27與28條件下獲得的蛋白表達(dá)量較高.其中，誘導(dǎo)組合3，8與16條件下蛋白條帶顏色最深，蛋白量相對較多，即誘導(dǎo)條件3：細(xì)胞OD600nm值為0.8，IPTG濃度為0.2 mM，誘導(dǎo)溫度為30 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為9 h；誘導(dǎo)條件8：細(xì)胞OD600nm值為0.6，IPTG濃度為0.1 mM，誘導(dǎo)溫度為25 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為7 h；誘導(dǎo)條件16：細(xì)胞OD600nm值為0.5，IPTG濃度為0.7 mM，誘導(dǎo)溫度為30 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為5 h；這3種組合下的誘導(dǎo)條件可作為DehI重組蛋白的表達(dá)條件.

2.2 粗酶活性分析

考慮到SDS-PAGE操作過程中的誤差，進(jìn)一步分析了不同組合誘導(dǎo)條件下獲得的粗酶液活性.如圖3所示，通過對不同組合酶活性分析，發(fā)現(xiàn)第3組誘導(dǎo)條件下所獲得的DehI催化活性最高為1.36 U/mL粗酶液，與常用誘導(dǎo)表達(dá)條件(OD600 nm為0.5，0.5 mM IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h)相比提高7.6倍；其次是第16組與第20組，催化活性分別是0.90 U/mL與0.75 U/mL粗酶液，與SDS-PAGE結(jié)果一致.綜上可知：第3組誘導(dǎo)條件即菌液OD600 nm為0.8，IPTG終濃度為0.2 mM，溫度為30 ℃，時(shí)間為9 h時(shí)，所獲得的活性蛋白量最高，因此可作為后續(xù)研究DehI的誘導(dǎo)表達(dá)條件.

圖3 不同誘導(dǎo)組酶催化活性

3 結(jié) 論

本研究對DL-2-鹵代酸脫鹵酶DehI進(jìn)行了蛋白的異源表達(dá)優(yōu)化.研究發(fā)現(xiàn)，在菌液OD600 nm為0.8，30 ℃，0.2 mmol/L IPTG，180 r/min，誘導(dǎo)9 h 條件下，DehI蛋白可溶性最好，活性最高，為后續(xù)獲得大量DehI活性蛋白及其構(gòu)效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ).