王書利，魏淑娟，李欣欣，張倪晨，武浩儀，廖增廣，姜雯雨，高萌萌，李夢(mèng)含，王倩，李志強(qiáng)*

(1.商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院，河南 商丘 476000；2.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453007)

布魯氏菌(Brucella)為革蘭氏陰性菌，是人和動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的兼性病原體，能夠在專業(yè)和非專業(yè)的吞噬細(xì)胞內(nèi)繁殖[1]，引起人和多種動(dòng)物發(fā)生疾病，給人類帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[2].布魯氏菌可在動(dòng)物體內(nèi)引起急性傳染病和妊娠動(dòng)物的流產(chǎn)[3].人布魯氏菌病的癥狀是發(fā)燒、關(guān)節(jié)炎、感染性心內(nèi)膜炎、脾膿腫、敗血癥和脊椎炎[4,5].在宿主體內(nèi)，為了促進(jìn)細(xì)菌繁殖，布魯氏菌必須適應(yīng)惡劣的胞內(nèi)環(huán)境脅迫并影響某些信號(hào)途徑和蛋白的表達(dá).已經(jīng)證實(shí)布魯氏菌中存在多種應(yīng)激相關(guān)蛋白和毒力相關(guān)蛋白，但其潛在致病機(jī)制尚不清楚.

PGK是負(fù)責(zé)編碼磷酸甘油酸激酶的重要基因.PGK可將磷酸基從1,3-二磷酸甘油酯轉(zhuǎn)移到ADP，形成ATP和3-磷酸甘油酯，是糖酵解和糖異生生成ATP的重要步驟[6].因此，PGK是布魯氏菌繁殖過程中非常重要的激酶.已有研究表明，布魯氏菌PGK突變體在骨髓源巨噬細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的毒力是減弱的[7].所以，PGK與布魯氏菌的毒力有關(guān).本研究評(píng)價(jià)了2308Δpgk突變株在環(huán)境壓力下的生存能力，以及對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性作用，目的是進(jìn)一步揭示布魯氏菌中PGK的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、培養(yǎng)基和細(xì)胞系

布魯氏菌S2308親本株和2308Δpgk突變株為本研究室保存；布魯氏菌液體培養(yǎng)基(TSB)和布魯氏菌固體培養(yǎng)基(TSA)購自美國BD公司；瓊脂粉購自日本Biosharp公司；氯化鈉購自上海生工生物工程股份有限公司；CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司；小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW 264.7)購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心.

1.1.2 主要試劑

多粘菌素B和脫氧膽酸鈉購自德國Sigma公司；慶大霉素購自美國Invitrogen公司；DMEM高糖、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司.

1.2 方法

1.2.1 體外環(huán)境壓力實(shí)驗(yàn)

將S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C接種于10 mL TSB培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長早期(OD600=0.6).然后將細(xì)菌培養(yǎng)至指數(shù)生長期，接種于1.5 M NaCl和3.0 M NaCl中，刺激30 min.另外，在37 ℃培養(yǎng)條件下，將細(xì)菌在pH值為2、4、6、8、10、12的TSB培養(yǎng)基中刺激5 min，或者將指數(shù)生長期的細(xì)菌轉(zhuǎn)移至預(yù)熱40 ℃、50 ℃或60 ℃的TSB培養(yǎng)基中，在40 ℃、50 ℃或60 ℃下孵育1 h.刺激后將各組細(xì)菌離心后，10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度涂布TSA平板，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)，以在正常TSB培養(yǎng)基中生存的細(xì)菌為對(duì)照(存活率100%)，計(jì)算各組細(xì)菌的存活率.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行.

1.2.2 多粘菌素B敏感性實(shí)驗(yàn)

按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法測(cè)定S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C對(duì)多粘菌素B[8]和脫氧膽酸鈉的敏感性[9].離心培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期(OD600=1.0)的S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C，用PBS緩沖液，制備成約1 × 104CFU/mL的細(xì)菌懸液.將100 μL細(xì)菌懸液與100 μL不同濃度的多粘菌素B(終濃度分別為0.5、1和2 mg/mL)或脫氧膽酸鈉(終濃度分別為0.1、0.2和0.4 mg/mL)混合后培養(yǎng)于96孔板中.在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)1 h，取50 μL進(jìn)行10倍梯度稀釋后，選擇合適的稀釋度涂布TSA平板，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行CFU計(jì)數(shù).以未加多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的細(xì)菌為對(duì)照(存活率100%)，用存活菌的CFU除以接種菌的CFU，計(jì)算存活率.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行.

1.2.3 巨噬細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法，分別用50∶1、100∶1和1000∶1感染復(fù)數(shù)(MOI)的S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7[10]，用CytoTox 96非放射性細(xì)胞性法測(cè)定LDH水平[11].將小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7培養(yǎng)至6孔板內(nèi)，細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)至單層(約1 × 105個(gè)/孔)，分別用50∶1、100∶1和1000∶1感染復(fù)數(shù)(MOI)的S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C感染細(xì)胞.感染后的細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，感染45 min后，細(xì)胞用不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液漂洗兩次，隨后加入含50 μg/mL慶大霉素的DMEM，孵育1 h，殺死胞外菌.1 h后棄去培養(yǎng)液，加入新鮮的含25 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液(此時(shí)定義為0 h).在感染后12、24和48 h，按照試劑盒說明書測(cè)定LDH水平.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行.

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

細(xì)菌對(duì)多粘菌素B、脫氧膽酸鈉的敏感性和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性以平均值±SD表示.用SPSS 17.0分析突變株與親本株之間的差異性，當(dāng)P值< 0.05時(shí)，差異顯著；P值< 0.01時(shí)，差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 PGK對(duì)應(yīng)激條件下布魯氏菌存活的影響

布魯氏菌可以在宿主細(xì)胞中生存，必須適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境.為了確定PGK突變是否影響布魯氏菌對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)，比較了S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C菌株在模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的各種應(yīng)激條件下的存活率.這些脅迫環(huán)境包括高鹽環(huán)境(1.5 M和3.0 M NaCl)、酸堿環(huán)境(pH 2、4、6、8、10、12)和熱休克環(huán)境(40 ℃、50 ℃、60 ℃).在不同的應(yīng)激條件下，2308Δpgk的存活率明顯低于S2308和2308Δpgk-C(P< 0.05)(圖1).在3.0 M NaCl刺激條件下，各菌株的存活率明顯低于1.5 M NaCl刺激條件下的存活率(圖1A).在pH 2、4、8、10、12刺激條件下，各菌株的存活率均低于pH 6刺激條件下的存活率(圖1B).在不同溫度下熱休克處理后，各菌株的存活率隨溫度的升高而降低(圖1C).結(jié)果表明，PGK的缺失改變了布魯氏菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，PGK對(duì)布魯氏菌適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境具有重要意義.

圖1 布魯氏菌對(duì)體外應(yīng)激的敏感性

2.2 PGK對(duì)多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性

圖2 布魯氏菌對(duì)多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性

為了評(píng)定2308Δpgk突變體對(duì)多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性，我們測(cè)定了2308Δpgk突變體在多粘菌素B和脫氧膽酸鈉處理下的存活情況.結(jié)果表明，與S2308和2308Δpgk-C相比，多粘菌素B和脫氧膽酸鈉處理后，2308Δpgk的存活率顯著降低(P< 0.05)(圖2).此外，2308Δpgk突變體隨著多粘菌素B和脫氧膽酸鈉濃度的降低而敏感性增加(圖2).結(jié)果表明，PGK的失活導(dǎo)致布魯氏菌對(duì)多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性增加.

2.3 PGK調(diào)節(jié)S2308對(duì)巨噬細(xì)胞的殺傷作用

為了檢測(cè)S2308對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性是否受PGK調(diào)節(jié)，我們用S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C以50,100和1000的MOI感染的原代264.7細(xì)胞，測(cè)定LDH釋放水平.當(dāng)MOI為50∶1時(shí)，在感染后的不同時(shí)間，對(duì)乳酸脫氫酶的釋放水平，菌株之間沒有顯著差異(圖3A).當(dāng)MOI為100∶1時(shí)，在感染后12 h，S2308感染細(xì)胞和2308Δpgk-C感染細(xì)胞LDH釋放率分別為(33.12 ± 1.11%)和(31.93 ± 1.62)%；而2308Δpgk感染的巨噬細(xì)胞的LDH釋放率僅為(3.75 ± 0.26)%(圖3B).在感染后24 h，S2308感染細(xì)胞和2308Δpgk-C感染細(xì)胞LDH釋放率分別為(46.38 ± 2.15)%和(44.55 ± 0.57)%；而2308Δpgk感染的巨噬細(xì)胞的LDH釋放率僅為(7.94 ± 0.09)%(圖3B).當(dāng)MOI為1000∶1時(shí)，在感染后12 h，S2308感染細(xì)胞和2308Δpgk-C感染細(xì)胞LDH釋放率分別為(59.03 ± 2.08)%和(57.52 ± 1.59)%；而2308Δpgk感染的巨噬細(xì)胞的LDH釋放率僅為(2.95 ± 0.72)%(圖3C).在感染后24 h，S2308感染細(xì)胞和2308Δpgk-C感染細(xì)胞LDH釋放率分別為(73.55 ± 1.57)%和(71.84 ± 2.38)%；而2308Δpgk感染的巨噬細(xì)胞的LDH釋放率僅為(6.83 ± 0.79)%(圖3C).然而，在感染后48 h，感染S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C的巨噬細(xì)胞中，所有MOI的細(xì)胞都顯示出高水平的LDH釋放率(圖3).結(jié)果表明，2308Δpgk突變株在感染后12和24 h內(nèi)在任何MOI中均不誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的細(xì)胞毒性.此外，在感染后48 h，所有菌株對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性均增高，可能是由于長期感染時(shí)間而導(dǎo)致營養(yǎng)缺乏的結(jié)果.因此，感染后48 h，各菌株對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性無明顯差異.結(jié)果表明，S2308對(duì)細(xì)胞的毒性受PGK調(diào)節(jié).

圖3 PGK調(diào)節(jié)布魯氏菌對(duì)巨噬細(xì)胞的殺傷作用

3 討 論

布魯氏菌需要適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境，逃避宿主固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，才能成功存活[12].已有研究表明，布魯氏菌PGK突變株在細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的存活能力降低，在控制細(xì)菌毒力方面發(fā)揮了重要作用[7].為了更好地在宿主細(xì)胞中生存，布魯氏菌逐步具備了適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的能力，如熱休克、酸性pH值和高鹽[13].在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)2308Δpgk在高鹽、不同pH和熱休克的脅迫條件下降低了其存活能力.此外，研究還發(fā)現(xiàn)在2308ΔPGK中，多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性增加.這些結(jié)果表明PGK可能在布魯氏菌存活中發(fā)揮重要作用.

已有研究報(bào)道表明，布魯氏菌可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性[14].近年來，Lei和Li[10，11，15]等人研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌的細(xì)胞毒性依賴于熱休克蛋白HFQ、二元調(diào)控系統(tǒng)TceSR和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GntR.在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌的細(xì)胞毒性也受到PGK的調(diào)節(jié).這意味著布魯氏菌對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性不僅僅取決于IV分泌系統(tǒng)(T4SS)、二元調(diào)控系統(tǒng)(TCS)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子.

本研究表明，2308Δpgk增加了對(duì)體外應(yīng)激條件、多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性.此外，我們還觀察到PGK調(diào)節(jié)布魯氏菌對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性.這些結(jié)果表明PGK參與了布魯氏菌的胞內(nèi)外存活.然而，PGK調(diào)節(jié)布魯氏菌的具體功能和作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究.