賀蕾 ，包小華 ，李相梅 ，周晶瑩 ，褚彥飛 ，孫博 ，谷鐵軍

1.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012；2.吉林大學(xué)艾滋病疫苗國家工程實驗室，吉林 長春 130012 ；3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第964 醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 長春 130000；4.上海瑞宙生物科技有限公司，吉林 長春 130012

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染易導(dǎo)致全球15 ～44歲女性罹患宮頸癌，是常見的女性惡性腫瘤之一。HPV 常見型別有HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52 等。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將黏膜型HPV 根據(jù)病毒致癌潛力，分為低危型（low-risk types）和高危型（high-risk types）［1］。低危型HPV 感染會促使生殖器疣的增生；高危型 HPV在女性中會引起子宮頸、外陰、陰道和肛門等多個部位發(fā)生癌癥［2］，而在男性中，可導(dǎo)致肛門癌和陰莖癌［3］。

感染細(xì)菌和病毒是已知的癌癥危險因素，而在世界范圍內(nèi)，HPV 感染引起的癌癥率僅次于引起胃癌的幽門螺旋桿菌［4］。持續(xù)的高危型HPV 感染會導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生。因此，預(yù)防宮頸癌的主要方法是進(jìn)行定期的人體篩查。截至目前為止，宮頸癌的檢查方法主要包括HPV-DNA 的檢測及對于宮頸細(xì)胞異型增生的檢測［5］。同時，接種疫苗也是一種常見的預(yù)防手段。目前已上市或在研的HPV 預(yù)防性疫苗均以HPV L1 VLP 為主要抗原成分。HPV L1 蛋白具有自主裝能力，可自發(fā)組裝成由72個五聚體組成的VLP［6-7］。就國內(nèi)市場而言，已成功上市的Gardasil?（Merck）、Gardasil?9（Merck）、Cervarix?（GSK）［8-9］、Cecolin?（廈門萬泰）均是以 HPV L1 VLP 蛋白為主要抗原，通過不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白，采用多個蛋白與佐劑聯(lián)合使用的方法，起到預(yù)防多個HPV 型別感染的作用。

本研究構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-6L1，通過添加分子伴侶（TF、GroES-GroEL、DnaK-DnaJ-GrpE）篩選能夠增加目的蛋白表達(dá)的最佳條件，將純化的HPV6 L1 VLP 蛋白免疫 BALB ／ c 小鼠，采用假病毒中和試驗檢測小鼠血清中和抗體水平，為后續(xù)其他型別，尤其是高危型HPV L1 蛋白表達(dá)的研究提供參考，也為宮頸癌疫苗的研發(fā)提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞及病毒 感受態(tài)大腸埃希菌ER2566 購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；pUC57-6L1、pET30a（+）質(zhì)粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；分別表達(dá)分子伴侶TF、GroES-GroEL 和DnaK-DnaJ-GrpE 的質(zhì)粒 pTf16、pGro7 和 pKJE7 以及HPV6 型假病毒由吉林大學(xué)艾滋病疫苗國家工程實驗室保存；HEK-293FT 細(xì)胞購自美國Thermo 公司，由吉林大學(xué)艾滋病疫苗國家工程實驗室擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、HindⅢ購自日本 TaKaRa 公司；T4 DNA Ligase、2 × Rapid Ligation Buffer 購自美國 Promaga 公司；1 kb DNA marker 購自美國 NEB 公司；DMEM 液體培養(yǎng)基、FBS、胰酶、臺盼藍(lán)購自美國Gibco 公司；單克隆抗體CamVir 1 購自英國Abcam 公司；L-阿拉伯糖購自上海瑞永生物科技有限公司；IPTG 購自北京索萊寶科技有限公司；蔗糖購自遼寧泉瑞試劑有限公司；AP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 購自美國Jackson 公司；BCIP ／ NBT 顯色試劑盒購自美國 Sigma 公司；POROSTMXS 陽離子交換層析柱購自Thermo 公司；PAC300 型蛋白電泳儀、Trans-blot SD 型半干轉(zhuǎn)移電泳槽及細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)（Cytation3）購自美國BIO-TEK 公司；Nano ZS 型動態(tài)光散射檢測儀購自馬爾文帕納科（中國）公司。

1.3 實驗動物 SPF 級 BALB ／ c 小鼠，雌性，6 ～ 8周齡，體重約27 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物許可證號為：SCXK（遼）2015-0001。本動物實驗遵守國家實驗動物管理法律、法規(guī)、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和有關(guān)規(guī)定，使用合格的實驗動物。按照我國《實驗動物福利倫理審查指南（GB ／ T 35892-2018）》要求，通過實驗動物福利倫理審查，落實實驗動物福利倫理。

1.4 重組質(zhì)粒pET30a-6L1 的構(gòu)建 根據(jù)NCBI 登錄的全基因序列（Txid：31552），委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成具有密碼子優(yōu)化的HPV6 L1基因片段，經(jīng)NdeⅠ和HindⅢ雙酶切后，與原核表達(dá)載體 pET30a（+）25 ℃連接 30 min，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-6L1。

1.5 HPV6 L1 蛋白在大腸埃希菌中的可溶性表達(dá)將重組質(zhì)粒pET30a-6L1 轉(zhuǎn)化至感受態(tài)ER2566中，挑取單克隆菌落，接種至 5 mL 含 10 μg ／ mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基，于大容量全溫振蕩器，37 ℃，220 r ／ min 培養(yǎng)過夜；將菌液按 1 ∶100 的比例接種至 500 mL 含 50 μg ／ mL 卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃，220 r ／ min 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（A600= 0.6 ～ 0.8）；加入終濃度 0.1 mmol ／ L的 IPTG 進(jìn)行低溫誘導(dǎo)，25 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 16 h；4 ℃，2 831 × g 離心 30 min；棄上清，收集菌體，分裝并稱重，置-20 ℃冷凍保存。按 1 ∶10 比例加入 PBS，重懸菌體，冰浴條件下進(jìn)行超聲（超聲功率37% ～39%，超聲 5 s，停 5 s，超聲周期 30 min）；4 ℃，30 966 × g離心30 min；收集上清，用 30%蔗糖墊（wt ／ wt）濃縮后重懸，經(jīng)10% ～50%蔗糖密度梯度離心，分段收集蛋白樣品。

1.6 HPV6 蛋白共表達(dá)分子伴侶的篩選 將pET30a-6L1 質(zhì)粒與 pGro7、pKJE7 和 pTf16 分別共轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli ER2566 中，挑取單菌落，接種至5 mL含 50 μg ／ mL 卡那霉素和 20 μg ／ mL 氯霉素的 LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，220 r ／ min 振蕩培養(yǎng)過夜；按 1 ∶100 的比例接種至 500 mL 含 50 μg ／ mL 卡那霉素和 20 μg ／ mL 氯霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r ／ min 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期（A600= 0.6 ～ 0.8）；將培養(yǎng)溫度降至25 ℃，加入終濃度0.1 mmol ／ L 的IPTG 和 2 mg ／ mL 的 L-阿拉伯糖，誘導(dǎo) 16 h；4 ℃，2 831 × g 離心 30 min；棄上清，收集菌體，分裝并稱重，置-20 ℃冷凍保存。按 1 ∶10 比例加入 PBS，重懸菌體，冰浴條件下進(jìn)行超聲（超聲功率37% ～39%，超聲 5 s，停 5 s，超聲周期 30 min）；4 ℃，30 966 × g離心 30 min；收集上清，用 30%蔗糖墊（wt ／ wt）濃縮后重懸，經(jīng)10% ～50%蔗糖密度梯度離心，分段收集蛋白樣品。

1.7 HPV6 L1 蛋白的鑒定 將菌體超聲液、30%蔗糖墊濃縮液及分段收集的蛋白樣品進(jìn)行12% SDSPAGE 鑒定。用上述方法將樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，電壓 16 V，轉(zhuǎn)膜 16 min，3%牛奶-PBS 溶液室溫振蕩封閉1 h；以Camvir 1 小鼠HPV 單克隆抗體為一抗（1 ∶5 000 稀釋），室溫振蕩孵育 1 h；AP 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 為二抗（1 ∶5 000 稀釋），室溫振蕩孵育45 min；加入顯色液（10 mL 堿性磷酸酶Buffer 中加入 33 μL BCIP 和 66 μL NBT），避光顯色至條帶清晰，進(jìn)行Western blot 鑒定。

1.8 HPV6 L1 蛋白的純化 將分段收集的蛋白樣品透析。將緩沖體系更換為緩沖液A（50 mmol ／ L Mops，250 mmol ／ L NaCl，10 mmol ／ L DTT，pH 7），并用緩沖液A 平衡POROSTMXS 陽離子交換層析柱，上樣，緩沖液 B（50 mmol ／ L Mops，1.5 mol ／ L NaCl，10 mmol ／ L DTT，pH 7）經(jīng) 20%、40%、60%、80%、100%梯度洗脫，分別得到含 0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mol／L NaCl 的洗脫液，進(jìn)行 12%SDS-PAGE 鑒定。

1.9 HPV6 L1 蛋白結(jié)構(gòu)表征的分析 采用粒度分析儀檢測純化后含1.25 mol ／ L NaCl 洗脫樣品的粒徑大小，并將粒徑正確的樣品送中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，透射電鏡下觀察VLP 形態(tài)。

1.10 HPV6 L1 VLP 免疫原性評價 將 BALB ／ c 小鼠隨機(jī)分為實驗組和PBS 對照組，每組6 只。將HPV6 L1 蛋白與A（lOH）3佐劑按1 ∶3 比例混合吸附，經(jīng)小鼠大腿外部肌肉免疫，2 μg HPV6 L1 + 6 μg A（lOH）3／ 只，共免疫2 次，間隔2 周。于初次免疫后2 周，經(jīng)眼眶采血，分離血清，直至28 周。

采用假病毒中和試驗檢測中和抗體滴度：預(yù)先6 h 鋪 HEK-293FT 細(xì)胞于 96 孔板中，1.5 × 104個 ／（孔·100 μL），37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將陽性血清進(jìn)行系列稀釋（2 周血清：1.6 × 103、3.2 × 103、6.4 × 103、1.28 × 104、2.56 × 104、5.12 × 104；28 周血清：4 × 102、8 × 102、1.6 × 103、3.2 × 103、6.4 ×103、1.28 × 104）。在 96 孔稀釋板上，每孔加入 60 μL假病毒稀釋液（200 TCID50／ 50 μL）及 60 μL 陽性血清稀釋液，振動混合30 s，每個稀釋度設(shè)4個復(fù)孔，同時設(shè)完全培養(yǎng)基替代陽性血清的陽性對照孔（VC）及培養(yǎng)基對照孔（CC）。將稀釋板冰浴1 h，從各孔取100 μL 假病毒血清混合物（或培養(yǎng)基）加至預(yù)先已鋪好細(xì)胞的培養(yǎng)板對應(yīng)孔中，混勻，培養(yǎng)72 h。用細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)分別檢測各孔熒光斑點數(shù)。用SPSS Statistics 22 軟件計算各時間點血清中和抗體滴度，概率為50%時對應(yīng)的稀釋度即為樣品血清中和抗體滴度。以小鼠采血時間為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的中和抗體滴度的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，用GraphPad Prism 5 軟件繪制不同免疫組血清中和抗體滴度隨時間變化情況的曲線圖。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pET30a-6L1 的鑒定 質(zhì)粒的雙酶切（NdeⅠ／ HindⅢ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1 500 bp 的目的條帶，大小與HPV6 L1 基因相符，見圖1。表明重組質(zhì)粒pET30a-6L1 構(gòu)建正確。

圖1 重組質(zhì)粒 pET30a-6L1 的雙酶切（NdeⅠ／ HindⅢ）鑒定Fig.1 Restriction map of recombinant plasmid pET30a-6L1（NdeⅠ／ HindⅢ）

2.2 表達(dá)的HPV6 L1 蛋白的鑒定及共表達(dá)分子伴侶的篩選 表達(dá)的HPV6 L1 蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE分析，相對分子質(zhì)量大小約55 000，與分子伴侶TF或GroES-GroEL 共表達(dá)時，HPV6 L1 蛋白表達(dá)量均有所提高，而與分子伴侶DnaK-DnaJ-GrpE 共表達(dá)時，HPV6 L1 蛋白表達(dá)量明顯降低，見圖2。通過灰度掃描量化分析可知，與分子伴侶TF 或GroES-GroEL共表達(dá)時，HPV6 L1 蛋白的表達(dá)量分別為未加分子伴侶時的2.08 和1.65 倍；而與分子伴侶DnaKDnaJ-GrpE 共表達(dá)時，蛋白表達(dá)量僅為初始水平的21.67%。表明分子伴侶TF 能使HPV6 L1 蛋白的可溶性表達(dá)量獲得較大提升。

圖2 HPV6 L1 蛋白的表達(dá)及共表達(dá)分子伴侶篩選的電泳圖Fig.2 Electrophoretic profile of expressed HPV6 L1 protein and screened co-expression molecular chaperone

2.3 純化HPV6 L1 蛋白的鑒定 陽離子交換層析純化后各梯度洗脫蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 分析，含1.25 mol ／ L NaCl 的洗脫液目的蛋白純度可達(dá)90%以上，見圖3。

圖3 純化的HPV6 L1 蛋白的SDS-PAGE 鑒定Fig.3 SDS-PAGE profile of purified HPV6 L1 protein

2.4 HPV6 L1 結(jié)構(gòu)表征 HPV6 L1 蛋白在液體中呈均一度較好的病毒樣顆粒，粒徑為61.40 nm，多分散指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）為 0.071，見圖4。

圖4 HPV6 L1 VLP 蛋白的動態(tài)光散射分析Fig.4 Dynamic light scattering analysis of HPV6 L1 VLPs

2.5 HPV6 L1 VLP 形態(tài)觀察 HPV6 L1 VLP 是呈均一的、直徑45 ～65 nm 的球狀結(jié)構(gòu)，與HPV6 天然病毒顆粒的形態(tài)、大小相似，見圖5。

圖5 HPV6 L1 VLP 的透射電鏡觀察（× 30 000）Fig.5 Transmission electron microscopy of HPV6 L1 VLPs（× 30 000）

2.6 免疫原性 小鼠血清中和抗體滴度約從初次免疫后2 周起產(chǎn)生，第8 周時達(dá)到峰值，為105以上，之后雖略有下降進(jìn)入平臺期，但仍保持在較高水平，直至20 周仍可產(chǎn)生較好保護(hù)效果，見圖6。

圖6 HPV6 L1 VLP 免疫小鼠血清中和抗體滴度Fig.6 Titers of serum neutralizing antibody in mice immunized with HPV6 L1 VLP

3 討 論

每年約7 900 萬人感染HPV［10］。據(jù)估計，99%的宮頸癌、90%的肛癌、65%的陰道癌、50%的外陰癌和 45% ～ 90%的口咽癌是由 HPV 感染引起［11］，疫苗接種已成為控制HPV 感染的必要手段。本研究選用HPV6 L1 蛋白進(jìn)行表達(dá)條件的篩選及免疫原性評價，為后續(xù)疫苗研發(fā)提供了數(shù)據(jù)支撐。

本研究構(gòu)建了能夠成功表達(dá)HPV6 L1 蛋白的重組質(zhì)粒，同時優(yōu)化了表達(dá)條件。鑒于HPV L1 VLP 在大腸埃希菌中的表達(dá)多以包涵體形式存在［12］，同時分子伴侶可幫助其他大分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)象折疊或展開以及組裝或拆卸［13］，因此，本研究期望可通過添加分子伴侶來增加可溶性目的蛋白的表達(dá)。候選的TF、GroES-GroEL、DnaK-DnaJ-GrpE 分子伴侶具有不同特點。TF 分子伴侶是一種組成型表達(dá)蛋白，可避免在翻譯過程中產(chǎn)生無用的分子內(nèi)作用，協(xié)助蛋白質(zhì)折疊并增加蛋白表達(dá)［14］，而本文結(jié)果也證實了這一結(jié)論。分子伴侶GroEL 及其伴侶蛋白GroES 屬于熱休克蛋白家族Hsp60 ／Hsp10，可介導(dǎo)蛋白質(zhì)的折疊［15］。DnaK（Hsp70）是相對分子質(zhì)量69 000 的單分子雙結(jié)構(gòu)域蛋白，在促進(jìn)多聚體蛋白的折疊、易位以及組裝和拆卸等方面發(fā)揮核心作用，可防止錯誤折疊和聚集。為了在體內(nèi)正常發(fā)揮作用，DnaK 需要另外兩種輔助因子 DnaJ（Hsp40）和 GrpE 的協(xié)助。DnaJ 包含 1個保守的J 結(jié)構(gòu)域，是與DnaK 結(jié)合所必需的。DnaJ 可獨立地以低親和力結(jié)合未折疊的蛋白質(zhì)。GrpE 可觸發(fā)ADP從 DnaK 釋放，然后隨著 ATP 重新結(jié)合 DnaK［16-18］。

在病毒學(xué)中經(jīng)常使用假病毒中和試驗，可體外檢測阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的抗體或藥物的有效性，也適用于疫苗開發(fā)［19］。世界衛(wèi)生組織（WHO）將中和抗體水平作為評價HPV 預(yù)防型疫苗是否有效的金標(biāo)準(zhǔn)［20］。因此，本研究也選用該方法檢測了HPV6 L1 蛋白免疫小鼠血清中和抗體水平，峰值處可達(dá)105以上，且較高抗體水平可維持約20 周，具有良好的應(yīng)用前景。

本研究對HPV6 L1 蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化，可為后續(xù)其他型別蛋白的表達(dá)條件的探索提供參考；同時，中和抗體檢測結(jié)果顯示，獲得的HPV6 L1 VLP具有一定的保護(hù)效果，可為后續(xù)多價宮頸癌疫苗的開發(fā)提供經(jīng)驗和數(shù)據(jù)。