王佩瑤，張凌怡，張維冰

（華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

天然酶在自然界中發(fā)揮著非常重要的作用，但其制備成本高、儲(chǔ)存條件嚴(yán)格，具有一定的局限性［1］。納米酶是具有類似天然酶催化活性的無(wú)機(jī)納米材料，作為新一代的人工酶，具有成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了天然酶的不足，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。自2007年Fe3O4納米粒子作為過(guò)氧化物酶的模擬物被發(fā)現(xiàn)以來(lái)［2］，大量基于納米酶的研究不斷涌現(xiàn)。典型的納米酶包括碳納米材料（如碳納米管、氧化石墨烯、碳量子點(diǎn)），金屬納米粒子（如Ag、Au、Pt、Pd），金屬氧化物（如Fe3O4），金屬有機(jī)框架材料（Metal organic frameworks，簡(jiǎn)稱MOFs）及各種復(fù)合材料等。納米酶已被運(yùn)用在越來(lái)越多的領(lǐng)域，如對(duì)離子、分子、癌細(xì)胞等的檢測(cè)，對(duì)環(huán)境污染物的處理，在抗菌、抗癌、抗氧化方面的應(yīng)用等［3］。

MOFs 是由金屬離子/簇與有機(jī)配體配位而成的多孔材料，具有大量的活性位點(diǎn)，研究表明MIL-53、MIL-88、MIL-100 和MIL-101 等MOFs 具有良好的催化活性［4］。如MIL-53（Fe）被證明具有類過(guò)氧化物酶活性，在H2O2的存在下可以催化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和鄰苯二胺（OPD）的氧化，并實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的比色檢測(cè)［5］。MOFs 材料具有良好的類過(guò)氧化物酶活性，Valekar 等［6］使用N，N，N'，N'-四甲基-1，4-丁二胺（TMBDA）將MIL-100（Fe）功能化后與膽堿和乙酰膽堿特異性酶結(jié)合，成功地檢測(cè)了牛奶和血清中分別存在的膽堿和乙酰膽堿。Xu等［7］采用微波輔助法合成了Fe3O4@MIL-100（Fe），證實(shí)該材料具有良好的類過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，發(fā)展了簡(jiǎn)單有效的谷胱甘肽比色檢測(cè)法，該方法的線性范圍為1 ～45μmol/L，檢出限（LOD）為0.26μmol/L。

碳納米材料作為典型的類酶材料，成為納米酶研究的熱點(diǎn)。Song 等［8］合成了羧基修飾的氧化石墨烯（GO-COOH），并成功用于葡萄糖的檢測(cè)。Zhang等［9］制備了ZIF-8-還原氧化石墨烯（ZIF-8-rGO）負(fù)載的雙金屬（AuPt）納米顆粒，并作為一種新型的過(guò)氧化物酶模擬物用于H2O2的高靈敏度檢測(cè)。Li等［10］將氮雜原子（N）摻雜到Q-石墨烯（QG）中，制備得到的碳基納米酶具有高特異性的類過(guò)氧化物酶催化活性，其催化性能大大提高。煤系針狀焦（NC）是以煤焦油、瀝青及其重要餾分為原料［11］制成的固體炭材料，在顯微鏡下具有明顯的針狀紋理結(jié)構(gòu)，片層狀結(jié)構(gòu)堆積整齊［12］，其結(jié)構(gòu)及組成與石墨烯相似，可用于制備特種炭素材料及其復(fù)合材料、超高功率電極［11］等。目前將石墨烯作為納米酶的研究較多，然而并無(wú)基于針狀焦的納米酶的相關(guān)報(bào)道?？紤]到針狀焦的低成本及其與石墨烯的相似性，發(fā)展基于針狀焦的新型復(fù)合納米酶具有極大的應(yīng)用潛力。

生物硫醇主要包括谷胱甘肽和半胱氨酸，在人體代謝中起著至關(guān)重要的作用。體液中這些低分子量硫醇的異常水平與一些疾病密切相關(guān)，包括糖尿病、癌癥和心血管疾病等［13］，因此發(fā)展谷胱甘肽和半胱氨酸的檢測(cè)方法具有重要的生物學(xué)意義。目前已發(fā)展了各類材料用于生物硫醇的檢測(cè)，如FeS2/SiO2［14］、MoS2@CoFe2O4［15］、Ru@G［16］、Fe3+［17］等。Liu等［18］利用靈芝多糖還原并功能化氧化石墨烯，并將得到的材料用于半胱氨酸檢測(cè)，檢出限為0.1μmol/L，線性范圍為2 ～30μmol/L；Deng 等［19］制備了鐵和氮共摻雜的石墨烯量子點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了復(fù)方氨基酸片中半胱氨酸的檢測(cè)；Wu等［20］合成了石墨氮化碳并將其應(yīng)用于血清樣品中半胱氨酸的檢測(cè)。

本文以針狀焦為基底，利用其與MIL-100（Fe）間的靜電相互作用制備了復(fù)合材料NC@MIL-100（Fe），對(duì)材料進(jìn)行表征并研究了其類過(guò)氧化物酶活性。以NC@MIL-100（Fe）為納米酶發(fā)展了谷胱甘肽和半胱氨酸的分析方法，優(yōu)化了分析條件，并進(jìn)一步應(yīng)用于實(shí)際樣品人血清中生物硫醇濃度的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

煤系針狀焦由鞍山熱能院提供；均苯三甲酸（H3BTC）購(gòu)于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙醇、硝酸、氯化鉀購(gòu)于上海凌峰試劑有限公司；精氨酸（Arg）購(gòu)于上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；九水硝酸鐵（Fe（NO3）3·9H2O）、30%過(guò)氧化氫（30% H2O2）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷胱甘肽（GSH）、二甲基亞砜（DMSO）、L-半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙酸鈉（NaAc）、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、氯化鈉、氯化鎂、乙酸（HAc）、L-組氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）等其他氨基酸購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；健康人血清來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

S-3400N 掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司）；JEM-1400 生物透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會(huì)社）；FT-IR 6700傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)尼高力公司）；D/max2550VB/PC X 射線衍射儀（XRD，日本理學(xué)電機(jī)）；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 NC@MIL-100（Fe）的制備

將14.43 g Fe（NO3）3·9H2O 與5.04 g H3BTC 溶于36 mL 水中，超聲1 h，隨后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中160 ℃下反應(yīng)12 h，之后加水在70 ℃下攪拌3 h，再加乙醇在65 ℃下攪拌3 h以洗去雜質(zhì)。最后將所得材料置于50 ℃真空烘箱下過(guò)夜烘干，得到MIL-100（Fe）［21］。

稱取500 mg針狀焦，倒入60 mL濃硝酸，60 ℃油浴下攪拌7 h，水洗至中性后置于50 ℃烘箱過(guò)夜，得到酸化后的針狀焦。

將7.21 g Fe（NO3）3·9H2O與2.52 g H3BTC溶于18 mL水中，取25 mg酸化后的針狀焦溶于50 mL水。將以上兩種溶液分別超聲1 h，之后將兩者混合攪拌1 h，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中150 ℃下反應(yīng)15 h。反應(yīng)完成后，將材料離心，之后加水在70 ℃下攪拌3 h，再加乙醇在65 ℃下攪拌3 h，洗去雜質(zhì)。最后將所得材料置于90 ℃烘箱下過(guò)夜烘干，得到NC@MIL-100（Fe）。

1.3 NC@MIL-100（Fe）的類過(guò)氧化物酶活性研究

將4.8μL TMB（10 mg/mL）、100μL 30%的H2O2及20μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）與0.2 mol/L的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，使反應(yīng)液總體積為1 mL。隨后在37 ℃下孵育，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其在500 ～800 nm 波長(zhǎng)范圍的吸收光譜，并考察其在652 nm 波長(zhǎng)下的吸光度隨時(shí)間的變化曲線。作為對(duì)比，針狀焦和MIL-100（Fe）也在相同條件下測(cè)試。

在保持其他條件一致的情況下，考察了不同的H2O2濃度（0.1 ～5 mmol/L），TMB濃度（0.1 ～4 mmol/L），納米酶質(zhì)量濃度（2 ～100μg/mL）及孵育時(shí)間（5 ～30 min）下，反應(yīng)體系在652 nm波長(zhǎng)下吸光度的大小。

取20μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），不同體積（1.2、2.4、4.8、7.2、9.6、12、16.8、24μL）的TMB溶液（10 mg/mL）與0.2 mol/L的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，37 ℃下孵育20 min，加入100μL 30%的H2O2使反應(yīng)液總體積為1 mL，檢測(cè)其在652 nm波長(zhǎng)下的吸光度隨時(shí)間的變化。將吸光度增加速率轉(zhuǎn)換為催化反應(yīng)速度v，并將v和底物濃度擬合到米氏方程，計(jì)算動(dòng)力學(xué)常數(shù)Vmax和Km。米氏方程如下所示：

其中Vmax為飽和底物濃度下的最大反應(yīng)速率，［S］是底物的濃度，Km是米氏常數(shù)。Km反映了納米酶對(duì)其底物的親和力，定義為最大速率一半時(shí)的底物濃度，Km越小說(shuō)明材料對(duì)底物的親和力越強(qiáng)。

以H2O2為底物時(shí)，取20μL 的NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），不同體積（1、2、4、6、8、10、14、20 μL）的H2O2溶液（50 mmol/L）與0.2 mol/L 的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，37 ℃下孵育20 min，加入120μL TMB溶液（10 mg/mL）使反應(yīng)液總體積為1 mL，其他步驟同上。

1.4 對(duì)生物硫醇的檢測(cè)

將4.8 μL TMB 溶液（10 mg/mL），20 μL H2O2溶液（50 mmol/L），20 μL 的NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），不同體積（0、0.6、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18μL）的谷胱甘肽溶液（5 mmol/L）與0.2 mol/L的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，使反應(yīng)液總體積為1 mL，37 ℃下孵育20 min，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其在500 ～800 nm 波長(zhǎng)處的吸收光譜。檢測(cè)半胱氨酸時(shí)，則將谷胱甘肽溶液替換為不同體積（0、1、10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160、180μL）的半胱氨酸溶液（1 mmol/L），其他條件同上。

將4.8 μL TMB 溶 液（10 mg/mL），20 μL H2O2溶 液（50 mmol/L），20 μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），20μL 濃度為5 mmol/L 的組氨酸（His）、谷氨酸（Glu）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）、Na+、Mg2+和K+溶液與0.2 mol/L 的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，使反應(yīng)液總體積為1 mL。在37 ℃下孵育，并檢測(cè)其在652 nm波長(zhǎng)下的吸光度。

將4.8 μL TMB 溶 液（10 mg/mL），20 μL H2O2溶 液（50 mmol/L），20 μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），健康人血清與0.2 mol/L 的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，使反應(yīng)液總體積為1 mL 且最終人血清的濃度被稀釋10 倍。在37 ℃下孵育，并在652 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度。將吸光度變化值轉(zhuǎn)化為濃度，即可得到人血清中生物硫醇的含量。加標(biāo)實(shí)驗(yàn)分別將200μmol/L 和400μmol/L 的半胱氨酸加入上述反應(yīng)體系中，使其最終濃度被稀釋10倍，計(jì)算血清中生物硫醇的實(shí)際濃度和回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 NC@MIL-100（Fe）的制備與表征

由于煤系針狀焦表面基團(tuán)較少，為了使MIL-100（Fe）順利吸附，首先用濃硝酸氧化針狀焦，在其表面引入羥基、羧基等基團(tuán)。利用酸化后的針狀焦與MIL-100（Fe）間的靜電相互作用制備NC@MIL-100（Fe）具有成本低、一次制備產(chǎn)量較大、制備方法簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。

采用掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）對(duì)材料的形貌進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1 所示。針狀焦呈片層狀結(jié)構(gòu)，MIL-100（Fe）為直徑約100 nm 的顆粒；而從NC@MIL-100（Fe）的電鏡圖可看出，基于針狀焦的片層結(jié)構(gòu)，MIL-100（Fe）能較為均勻地分布在其上，減少了MIL-100（Fe）的團(tuán)聚現(xiàn)象。

圖1 NC（A）、MIL-100（Fe）（B）、NC@MIL-100（Fe）（C）的SEM圖及NC（D）、MIL-100（Fe）（E）、NC@MIL-100（Fe）（F）的TEM圖Fig.1 SEM images of NC（A），MIL-100（Fe）（B），NC@MIL-100（Fe）（C）and TEM images of NC（D），MIL-100（Fe）（E），NC@MIL-100（Fe）（F）

圖2A 為材料的XRD 表征結(jié)果。可看出針狀焦在26.3°（002）［21］處出現(xiàn)了較強(qiáng)的衍射峰；MIL-100（Fe）在5.3°（333）、10.8°（428）、14.2°（088）、18.2°（7911）、24°（6618）和27.7°（9321）處出現(xiàn)了衍射峰，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［22］；而在NC@MIL-100（Fe）中，MIL-100（Fe）的衍射峰均有出現(xiàn)，但針狀焦的衍射峰并不明顯，可能是因?yàn)镸IL-100（Fe）較多的覆蓋在針狀焦的表面。圖2B為材料的紅外光譜圖，針狀焦中3424、1654、1631、1051 cm-1處的峰分別對(duì)應(yīng)O—H、—C==O、—C==C、—C—O基團(tuán)；MIL-100（Fe）中3417、1623、1574、1446、758、711 cm-1處的峰分別對(duì)應(yīng)O—H基團(tuán)和苯環(huán)［23］；而在NC@MIL-100（Fe）中，針狀焦和MIL-100（Fe）的特征峰均有出現(xiàn)。圖2C為材料的N2吸附-脫附等溫線，可得到針狀焦、MIL-100（Fe）和NC@MIL-100（Fe）的BET比表面積分別為20.53、1354.92、912.38 m2/g。復(fù)合材料NC@MIL-100（Fe）仍保持了較大的比表面積。以上表征均證明NC@MIL-100（Fe）成功合成。

圖2 NC、MIL-100（Fe）和NC@MIL-100（Fe）的XRD圖譜（A）、紅外光譜（B）和N2吸附-脫附等溫線（C）Fig.2 XRD patterns（A），F(xiàn)T-IR spectra（B）and N2 adsorption-desorption isotherms（C）of NC，MIL-100（Fe）and NC@MIL-100（Fe）

2.2 類過(guò)氧化物酶活性研究

為了考察NC@MIL-100（Fe）材料作為納米酶的性能，對(duì)其類過(guò)氧化物酶活性進(jìn)行了研究。由于類過(guò)氧化物酶在H2O2的存在下可以催化TMB的氧化，使反應(yīng)體系由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色，因此使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)體系的吸光度進(jìn)行檢測(cè)，以吸光度的變化值為參數(shù)評(píng)價(jià)NC@MIL-100（Fe）的類酶活性。首先檢測(cè)了相同條件下，針狀焦、MIL-100（Fe）和NC@MIL-100（Fe）的吸收光譜及吸光度隨時(shí)間的變化曲線。如圖3A 所示，NC@MIL-100（Fe）在652 nm 下的吸光度明顯高于單獨(dú)的針狀焦與MIL-100（Fe）；圖3B 顯示在相同時(shí)間下，NC@MIL-100（Fe）吸光度的變化值最大，說(shuō)明在單位時(shí)間內(nèi)NC@MIL-100（Fe）的催化性能優(yōu)于針狀焦與MIL-100（Fe）。

圖3 NC、MIL-100（Fe）、NC@MIL-100（Fe）的紫外-可見(jiàn)吸收光譜（A）及吸光度隨時(shí)間的變化曲線（B）Fig.3 UV-Vis absorption spectra of NC，MIL-100（Fe），NC@MIL-100（Fe）（A）and the curves of absorbance versus time（B）conditions：4.8μL TMB（10 mg/mL），100μL 30%H2O2 and 20μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）

對(duì)納米酶催化條件進(jìn)行優(yōu)化（圖4），分別考察了其他條件不變時(shí)不同H2O2濃度、TMB 濃度、納米酶質(zhì)量濃度和孵育時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系相對(duì)吸光度的影響。結(jié)果顯示催化反應(yīng)的最佳條件為1 mmol/L H2O2、3 mmol/L TMB、80μg/mL NC@MIL-100（Fe）和20 min的孵育時(shí)間。

圖4 不同的H2O2濃度（A）、TMB濃度（B）、納米酶質(zhì)量濃度（C）及孵育時(shí)間（D）對(duì)反應(yīng)體系相對(duì)吸光度的影響Fig.4 The effect of different H2O2 concentrations（A），TMB concentrations（B），nanozyme mass concentration（C）and incubation time（D）on the relative absorbance of the reaction systemconditions：24μL TMB（10 mg/mL），20μL H2O2（50 mmol/L），20 min incubation time and 20μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）

分別以TMB 和H2O2為底物，研究了各材料的類過(guò)氧化物酶催化動(dòng)力學(xué)，結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，針狀焦的Km和Vmax較小，說(shuō)明針狀焦對(duì)底物的親和力較高，但催化反應(yīng)速度較慢；MIL-100（Fe）的Km和Vmax較大，說(shuō)明其催化反應(yīng)速度較快，但對(duì)底物的親和力較低；而不論是以TMB 還是以H2O2作為底物，NC@MIL-100（Fe）的Km值均介于針狀焦與MIL-100（Fe）之間，且Vmax值大于針狀焦和MIL-100（Fe），說(shuō)明該材料結(jié)合了針狀焦和MIL-100（Fe）的優(yōu)勢(shì)，對(duì)底物的親和力較高且催化反應(yīng)速度較快，具有良好的類過(guò)氧化物酶活性。

表1 各材料的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 The kinetic parameters of each material

表2列舉了其他納米酶和本文合成的納米酶的催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)。在分別以TMB和H2O2為底物的情況下，與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）相比，NC@MIL-100（Fe）的Km值比HRP小1.61倍和8.6倍，說(shuō)明該材料比天然酶對(duì)底物的親和力更強(qiáng)；與其他納米酶相比，NC@MIL-100（Fe）也表現(xiàn)出較為優(yōu)異的催化效果。

表2 各種納米酶Km值與Vmax值的對(duì)比Table 2 Comparison of Km and Vmax value of various nanozymes

（續(xù)表2）

2.3 對(duì)生物硫醇的檢測(cè)

基于NC@MIL-100（Fe）良好的類過(guò)氧化物酶活性，將其應(yīng)用于谷胱甘肽和半胱氨酸的分析。由于谷胱甘肽和半胱氨酸含有巰基，加入反應(yīng)體系后將與TMB競(jìng)爭(zhēng)H2O2因被還原而產(chǎn)生的羥基［15］，導(dǎo)致被氧化的TMB 含量減少，從而使反應(yīng)體系的藍(lán)色變淺。如圖5A 和圖5B 所示，隨著谷胱甘肽或半胱氨酸濃度的增加，反應(yīng)體系在652 nm下的吸光度逐漸減小。以吸光度的變化值（ΔA）為縱坐標(biāo)，不同的谷胱甘肽和半胱氨酸濃度為橫坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖（圖5C 和圖5D），發(fā)現(xiàn)在較高濃度下ΔA趨于飽和。在3 ～70μmol/L 范圍內(nèi)ΔA與谷胱甘肽的濃度呈線性關(guān)系，方程為ΔA=0.0143cGSH+9×10-6（r2=0.998），檢出限（LOD，3σ/S）為0.33μmol/L；在1 ～80μmol/L 范圍內(nèi)ΔA與半胱氨酸的濃度呈線性關(guān)系，方程為ΔA=0.0095cCys+0.0184（r2=0.998），LOD（3σ/S）為0.22μmol/L。

圖5 加入不同濃度谷胱甘肽（A）和半胱氨酸（B）的吸收光譜及體系吸光度隨兩者濃度的變化值（C、D）Fig.5 The UV absorption spectra（A，B）and changes in absorbance（C，D）with different concentrations of GSH and Cysconditions：20μL H2O2（50 mmol/L），4.8μL TMB（10 mg/mL）and 20μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）

表3為多種納米酶檢測(cè)谷胱甘肽和半胱氨酸的線性范圍及LOD 值。相比其他材料，NC@MIL-100（Fe）檢測(cè)的線性范圍更寬，且LOD較小，是檢測(cè)谷胱甘肽和半胱氨酸的良好材料。

表3 各納米酶對(duì)谷胱甘肽和半胱氨酸的線性范圍及LOD的比較Table 3 Comparison of the linear ranges and LODs of GSH and Cys detected by various nanozymes

2.4 反應(yīng)體系的選擇性

研究了其他氨基酸及離子對(duì)反應(yīng)體系的干擾情況。加入濃度均為100μmol/L的谷胱甘肽、半胱氨酸及干擾物質(zhì)，并檢測(cè)反應(yīng)體系的吸光度。由圖6可知，包含谷胱甘肽和半胱氨酸的反應(yīng)體系吸光度發(fā)生了明顯變化，溶液褪色明顯。以半胱氨酸為例，在幾種干擾物質(zhì)中，組氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、精氨酸對(duì)反應(yīng)體系具有一定的干擾，其濃度為100 μmol/L 時(shí)，相對(duì)誤差為10.6% ～18.9%；其它組分的干擾較小，濃度為100μmol/L 時(shí)，相對(duì)誤差為0.5%～8.3%，說(shuō)明反應(yīng)體系對(duì)谷胱甘肽和半胱氨酸的檢測(cè)具有較好的選擇性。但應(yīng)注意的是，若檢測(cè)過(guò)程中，反應(yīng)體系內(nèi)存在能被羥基自由基氧化的其他還原性物質(zhì)，則該還原性物質(zhì)也會(huì)與TMB 競(jìng)爭(zhēng)羥基自由基，從而對(duì)生物硫醇的檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

圖6 體系對(duì)GSH和Cys檢測(cè)的選擇性Fig.6 Selectivity of detection for GSH and Cysconditions：the interfering substance is 100μmol/L，and other conditions are the same as those in Fig.5

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

由于人血清中半胱氨酸的濃度遠(yuǎn)高于谷胱甘肽的濃度［25］，因此以血清中半胱氨酸為分析對(duì)象。檢測(cè)結(jié)果如表4 所示，人血清中生物硫醇的濃度為178 μmol/L，測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為（RSD）為4.2%。向上述樣品中分別加入200、400μmol/L 的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，得到其回收率為94.5%～103%，RSD 為2.3%～2.4%。結(jié)果表明該方法在實(shí)際樣品中的檢測(cè)效果良好。但基于本方法的檢測(cè)原理，如果樣品中同時(shí)含有谷胱甘肽和半胱氨酸，則本方法不能實(shí)現(xiàn)兩者的分別測(cè)定，僅能對(duì)其總量進(jìn)行估測(cè)。

表4 NC@MIL-100（Fe）用于人血清中半胱氨酸濃度的檢測(cè)Table 4 NC@MIL-100（Fe）for the detection of Cys concentration in human serum

3 結(jié)論

本文以針狀焦為基底，通過(guò)其與MIL-100（Fe）間的靜電相互作用制備了新型納米酶NC@MIL-100（Fe），并應(yīng)用于谷胱甘肽和半胱氨酸的分析。NC@MIL-100（Fe）不僅原料成本較低、使用量小、合成方法簡(jiǎn)單，且對(duì)底物的親和力較高，催化反應(yīng)速度較快。NC@MIL-100（Fe）作為性能優(yōu)良的納米酶，有望在生物樣品分析和疾病診斷等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。