唐 帥，張桂生，黃楊文，3，朱慎鈺，曾雪亮，何 新，3

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院龍南分院內(nèi)3科；2. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；3. 國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心江西省分中心；4. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科；5. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，江西贛州 341000）

食管癌的發(fā)病率和死亡率分別位列惡性腫瘤的第六和第四位［1］，已成為嚴(yán)重威脅我國人群健康的疾病之一。食管鱗癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌是食管癌的2種主要病理亞型，我國以ESCC 為主［2］。目前，絕大多數(shù)ESCC患者在臨床確診時(shí)已是中晚期，失去了治愈機(jī)會(huì)，五年生存率不足20%［3］。ESCC 的病因尚不清楚，既往研究表明，高溫飲食或飲酒引起的慢性食管損傷、食管炎癥和基因表達(dá)的改變都可能和食管惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)［4-5］。近年來，隨著對微生態(tài)學(xué)的深入研究，菌群失調(diào)已成為影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一。

健康的食管菌群是保持食管正常功能的重要因素之一，食管中有34個(gè)細(xì)菌屬被發(fā)現(xiàn)相對豐度＞1. 0，其中鏈球菌屬和厭氧菌是主要的優(yōu)勢菌屬，占微生物群的16%至70%［6-7］。食管菌群失調(diào)可以導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，包括食管相關(guān)疾?。ㄊ彻苎住arrett 食管和食管腫瘤等）和食管外疾?。ㄌ悄虿　⑾?、間質(zhì)性肺炎等）［8］。具核梭桿菌是一種口腔中的厭氧革蘭氏陰性菌，該菌的慢性感染與多種癌癥（口腔鱗癌、胰腺癌和大腸癌）發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系［9-10］。具核梭桿菌可通過其表面的3 種生物分子，即脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、黏附素A（Adhesin A，F(xiàn)adA）和梭桿菌自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2（Fusobacterium autotransporter-2，F(xiàn)ap2）促進(jìn)大腸癌的發(fā)生和發(fā)展［11］。具核梭桿菌在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，然而具核梭桿菌和ESCC 發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系國內(nèi)外至今未見報(bào)道。本研究旨在闡明具核梭桿菌促進(jìn)ESCC 增殖的分子機(jī)制，為ESCC 的早期預(yù)測診斷和預(yù)防提供可能靶細(xì)菌和腫瘤生物標(biāo)志物，并為ESCC 的治療提供可能的靶標(biāo)，為ESCC 的早期診斷和治療提供新的方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 臨床樣本的16S rRNA 測序本研究選取病理確診的25 份ESCC 組織樣本及作為對照的25 份健康人組織，提取基因組DNA 并使用通過PCR擴(kuò)增16S rRNA 基因的高變V4 區(qū)，引物序列為515F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' 和 806R： 5'-GGACTACNNGGGTTATCTAAT-3'。本研究經(jīng)患者及家屬同意并簽署知情同意書，并已獲得我院人與動(dòng)物護(hù)理和使用機(jī)構(gòu)委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1. 2 細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)具核梭桿菌ATCC25586、溶血孿生球菌ATCC10379 被選為實(shí)驗(yàn)細(xì)菌。具核梭桿菌ATCC25586 在Wilkins 培養(yǎng)基、溶血孿生球菌ATCC10379 在血瓊脂平板中分別在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)2 d。人食管癌細(xì)胞株TE-1 和EC18 由上海北諾生物科技有限公司提供。TE-1 和EC18 細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清和5 000 U·mL-1青霉素/鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1. 3 具核梭桿菌ATCC25586 感染人食管癌細(xì)胞株TE-1 和EC18具核梭桿菌接種在Wilkins 培養(yǎng)基中，并在37 ℃含有5% CO2和95% N2的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。具核梭桿菌振搖過夜，收集加入1 mL 1×PBS 后在培養(yǎng)基中輕輕刮下接種環(huán)上的菌落，EP管中菌懸液制備好并吹勻，然后在96 孔板中加入100 μL 菌懸液。通過酶標(biāo)儀檢測菌懸液的OD 值（定義1 OD 值大約等于108CFU·mL-1），使用含有10% 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基制備1011·L-1的細(xì)菌溶液。TE-1 和EC18 細(xì)胞接種于2×10 個(gè)/孔的12孔板培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90% 時(shí)用于實(shí)驗(yàn)，PBS 洗滌細(xì)胞，使用不含鏈霉素和青霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基代替生長培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，用PBS洗滌細(xì)胞3 次，向細(xì)胞中加入細(xì)菌溶液培養(yǎng)24 h 進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。在隨后的所有實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為2組并分別用具核梭桿菌［感染復(fù)數(shù)（MOI）=200］和溶血孿生球菌（MOI=100）進(jìn)行感染，溶血孿生球菌作為對照菌。

1. 4 3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基-2H-溴化四唑測定（MTT 實(shí)驗(yàn)）TE-1 和EC18 細(xì)胞用具核梭桿菌或溶血孿生球菌感染24 h，接種在96 孔板中，并在指定的時(shí)間點(diǎn)用100 μL無菌MTT染色液在37 ℃下染色4 h，去除培養(yǎng)基，然后加入150 μL 二甲亞砜，在570 nm處測量吸光度。

1. 5 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)將TE-1 和EC18 細(xì)胞用具核梭桿菌或溶血孿生球菌感染24 h，取對數(shù)生長期細(xì)胞用0. 25% 胰蛋白酶消化并輕輕吹打，用含20% 胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106·L-1。鋪下層膠：按1∶1 比例將1. 2% 的瓊脂糖膠和2×DMEM 培養(yǎng)基（含有2×抗生素和20% 的小牛血清）混合后，分別取3 mL 混合液注入直徑6 cm 平皿中，室溫等待平皿中混合液冷卻凝固。鋪上層膠：按1∶1比例將0. 7% 的瓊脂糖和2×DMEM 培養(yǎng)基在無菌試管中，再向管中加入0. 2 mL 的細(xì)胞懸液，混合均勻后，注入鋪有1. 2% 瓊脂糖底層平皿中，逐漸形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37 ℃5%CO2溫箱中培養(yǎng)10 d。把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。

1. 6 蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)驗(yàn)TE-1 和EC18 細(xì)胞在感染具核梭桿菌或溶血孿生球菌24 h 后進(jìn)行蛋白提取和BCA 定量，根據(jù)BCA 定量結(jié)果進(jìn)行上樣，通過SDS-PAGE 分離等量的總蛋白，電轉(zhuǎn)移PVDF 膜上，并在4 ℃下與一抗TLR4（1∶1 000）、MYD88（1∶1 000）、C-myc（1∶1 000）、CyclinD1（1∶1 000）、NF-κB（標(biāo)準(zhǔn)化為NF-κB/P65 及P50，1∶1 000）、GAPDH 多克隆抗體（1∶1 000）孵育過夜，室溫與二抗A9169 和A9044（1∶5 000）孵育1 h，洗膜4次，每次15 min。將混合好的顯影液滴上PVDF膜上，進(jìn)行顯影。

1. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 22. 0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示處理后的數(shù)據(jù)，用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 具核梭桿菌在ESCC 患者腫瘤組織中明顯富集使用Illumina Hiseq2500 PE250 系統(tǒng)對25 例ESCC患者和25例健康人（HS）的食管鱗癌組織細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA 基因測序分析。共生成了3 411 301個(gè)過濾序列。每個(gè)樣本觀察到的操作分類單位（OTU）數(shù)量的曲線顯示，觀察到OTU 平均數(shù)達(dá)到大約25 000 個(gè)序列讀數(shù)的平臺(tái)表明每組中呈現(xiàn)的大約所有OTU 都被檢測到并且足以識(shí)別大多數(shù)每個(gè)食管微生物組的細(xì)菌群落成員（圖1A）。在屬水平上，ESCC 患者食管中鏈球菌（Streptococcus）、梭桿菌（Fusobacterium）、奈瑟菌（Neisseria）、溶血孿生球菌（Gemella）、普雷沃菌（Prevotella）等菌為優(yōu)勢菌；健康對照組食管中鏈球菌（Streptococcus）、鹽單胞菌（Halomonas）、普雷沃氏菌（Prevotella）、具核梭桿菌（Fusobacterium）、假單胞菌（Pseudomonas）等為優(yōu)勢菌（圖1B）。ESCC 食管細(xì)菌的微生物組與健康對照顯著不同，其中具核梭桿菌（P=0. 005）、溶血孿生球菌（P=0. 018）在ESCC 食管組織中含量最豐富（圖1C）。

圖1 ESCC患者食管組織菌群的豐度

2. 2 具核梭桿菌對ESCC 細(xì)胞增殖的影響選取在食管鱗癌組織和健康人群組織中差異聚集具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的溶血孿生球菌及PBS進(jìn)行對照。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)顯示：與加入溶血孿生球菌及PBS 相比，加入具核梭桿菌刺激后，TE-1 和EC18 細(xì)胞的生長速率明顯增強(qiáng)（圖2A）。同時(shí)，MTT 測定也顯示，與加入溶血孿生球菌及PBS 相比，加入具核梭桿菌刺激后，TE-1 和EC18 細(xì)胞的生長速率明顯增強(qiáng)（圖2B、2C）。

圖2 具核梭桿菌對ESCC細(xì)胞增殖的影響

2. 3 具核梭桿菌可能通過LPS 激活TLR4/MYD88/NF-κB 通路促進(jìn)食管鱗癌的增殖集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，與加入TLR4 通路抑制劑TAK-242 及PBS 組相比，加入具核梭桿菌或分離提取具核梭桿菌的脂多糖（LPS）刺激后，TE-1 和EC18 細(xì)胞的生長速率明顯增強(qiáng)。同時(shí)，MTT 測定也顯示，與加入TLR4通路抑制劑TAK-242及PBS組相比，加入具核梭桿菌或分離提取具核梭桿菌的脂多糖（LPS）刺激后，TE-1和EC18細(xì)胞的生長速率明顯增強(qiáng)（圖3）。Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與加入溶血孿生球菌及PBS 相比，加入具核梭桿菌刺激后，TLR4、MYD88、p-P65及p-P50表達(dá)上調(diào)；同時(shí)，與增殖相關(guān)的C-MYC、CyclinD1表達(dá)也上調(diào)（圖4）。

圖3 具核梭桿菌可能通過LPS影響食管鱗癌細(xì)胞增殖

圖4 具核梭桿菌感染后，TLR4/MYD88/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

3 討論

具核梭桿菌在牙周炎、闌尾炎、牙齦炎和頭部、頸部、肺部、肝臟、心臟等感染中起重要作用［12-14］，同時(shí)具核梭桿菌的慢性感染與多種腫瘤（包括口腔鱗癌、胰腺癌和大腸癌）發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系［10］。具核梭桿菌在食管鱗癌細(xì)胞增殖過程中的具體機(jī)制目前仍不清楚。GUO S H 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌可通過外泌體攜帶miRNA 促進(jìn)大腸癌轉(zhuǎn)移。ABED J等［16］研究證實(shí)，F(xiàn)ap2能通過識(shí)別大腸癌細(xì)胞表面因子Gal-GalNAc 促進(jìn)大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究探討了具核梭桿菌通過其毒力因子LPS 激活TLR4/MYD88/NF-κB 通路促進(jìn)食管鱗癌增殖的分子機(jī)制。首先，我們通過16S rRNA 測序分析了25 例食管癌患者及25例健康對照組的細(xì)菌群落組成，結(jié)果表明，ESCC 食管細(xì)菌的微生物組與健康對照顯著不同，其中，具核梭桿菌、溶血孿生球菌在ESCC食管組織中含量最豐富。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與加入溶血孿生球菌及PBS相比，加入具核梭桿菌刺激后，TE-1 和EC18 細(xì)胞的生長速率明顯增強(qiáng)，說明具核梭桿菌可能是一種特異的致病菌。YAMAMURA K等［17］研究證實(shí)了具核梭桿菌在食管鱗癌組織中出現(xiàn)明顯富集，且對食管鱗癌患者的生存時(shí)間產(chǎn)生了顯著影響。該研究和我們研究結(jié)果一致，提示具核梭桿菌在ESCC的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。

消化道細(xì)菌菌群失調(diào)導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展已有研究證據(jù)，比如幽門螺桿菌和胃癌、具核梭桿菌與大腸癌的發(fā)生都密切相關(guān)［18-19］。有學(xué)者研究報(bào)道，具核梭桿菌可通過其LPS與TLR4結(jié)合促進(jìn)大腸癌的發(fā)生、發(fā)展［20］。LPS 作為具核梭桿菌最為重要的毒力因子之一，在結(jié)直腸癌、胰腺癌和口腔癌鱗狀細(xì)胞癌中可以作用TLR4，促進(jìn)正常上皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)變［10］。TLR4 通過MYD88 激活NFκB通路促進(jìn)大腸癌的發(fā)生、發(fā)展已被報(bào)道［21］，那么具核梭桿菌能否通過TLR4/MYD88/NFκB 通路調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞的增殖？我們分別使用TLR4 通路抑制劑TAK-242 及單獨(dú)加入分離提取具核梭桿菌ATCC25586 的脂多糖（LPS）刺激人食管鱗癌細(xì)胞株TE-1 和EC18 細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)［22］。MTT 及集落形成實(shí)驗(yàn)表明，加入具核梭桿菌的LPS 可以促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖。Western Blot 實(shí)驗(yàn)表明，具核梭桿菌可以上調(diào)TLR4/MYD88/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。本研究主要從細(xì)胞水平研究具核梭桿菌可能通過LPS 激活TLR4/MYD88/NF-κB 通路促進(jìn)食管鱗癌的增殖。ABI A 等［23］曾報(bào)道LPS 能通過TLR4 途徑調(diào)控環(huán)狀RNA 的表達(dá)。FAN L 等［24］也證實(shí)環(huán)狀RNA 可用于ECSS 診斷或預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物，同時(shí)也可用于治療ESCC 的靶點(diǎn)。但是，具核梭桿菌是否也會(huì)通過其毒力因子LPS 調(diào)控環(huán)狀RNA 的表達(dá)促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖，目前尚不明確。本課題組下一步研究的方向，需確定具核梭桿菌是否可通過其毒力因子LPS 調(diào)控環(huán)狀RNA 的表達(dá)來促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖，為食管鱗癌的預(yù)防和早期診斷尋找到可供干預(yù)的靶標(biāo)。