卓平清,王 瀚 ,趙淑玲,王弋博,葉文斌,田鳳鳴

(1.隴南師范高等?？茖W(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院， 甘肅 隴南 742500；2.隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心， 甘肅 隴南 742500；3.天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院， 甘肅 天水 741000)

農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)發(fā)展的基本保障之一,化學(xué)農(nóng)藥的使用已引發(fā)了嚴(yán)重的環(huán)境問題.生物農(nóng)藥是指由微生物菌體或微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物或植物提取物制備而成的具有農(nóng)藥特性的產(chǎn)品,可分為農(nóng)用抗生素、植物源農(nóng)藥、微生物農(nóng)藥和動物源農(nóng)藥等[1].生物農(nóng)藥以其安全、高效和環(huán)境友好的特點越來越受到人們的重視.抗生素是指一類由微生物等次級代謝活動產(chǎn)生,具有一定抑菌活性的天然產(chǎn)物[2]，由于其優(yōu)良的生物活性,被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[3].農(nóng)用抗生素[4]是應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面的抗生素,如用于防除病、蟲害及雜草的抗生素[4],是由細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的能夠抑制危害農(nóng)作物的有害生物的次級代謝產(chǎn)物.

抗生素產(chǎn)生菌有細(xì)菌、放線菌和真菌,其中約75%是由放線菌產(chǎn)生的,用于臨床和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的抗生素中60%以上也是來源于放線菌[5].放線菌中的鏈霉菌更是產(chǎn)生抗生素的重要菌種.鏈霉菌是一種革蘭氏染色陽性的放線菌,細(xì)胞結(jié)構(gòu)與細(xì)菌相近,沒有真菌所含的纖維素和幾丁質(zhì),細(xì)胞核沒有核膜,核糖蛋白的亞單位是30 S和50 S,因此和細(xì)菌一樣均屬原核生物界.放線菌主要分布在土壤環(huán)境中,因其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新異,在藥物開發(fā)領(lǐng)域備受關(guān)注[6].隨著耐藥性的不斷增加,迫切需要研發(fā)出新型抗生素來應(yīng)對耐藥菌[7],而作為農(nóng)用抗生素的生物農(nóng)藥就顯得非常重要.作為綠色農(nóng)業(yè)重點推廣使用的新型藥劑——微生物農(nóng)藥,將逐漸成為化學(xué)農(nóng)藥的替代品.分離并篩選出具有抑菌活性的放線菌,研制開發(fā)新型的農(nóng)用抗生素生防菌劑是當(dāng)前植物病害防治的重要發(fā)展方向[8].本文從隴南成縣周邊多處核桃根際采集土樣篩選能產(chǎn)生農(nóng)用抗生素的放線菌,結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法對具有高抑菌活性的放線菌進(jìn)行了菌種鑒定,為后期抑菌活性的研究、抗菌活性成分的分離鑒定及生防農(nóng)藥的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

供試土壤采自甘肅省隴南市成縣觀光園核桃根際及隴南師專梁山校區(qū)核桃樹根際土壤.采集核桃根際土,取根際10 cm～30 cm土壤裝入無菌袋中并標(biāo)記.對所采集的土壤樣品進(jìn)行風(fēng)干和研碎并篩封裝于無菌袋中4℃保存?zhèn)溆?

1.1.2 供試菌株

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)由天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院微生物實驗室提供.

1.1.3 培養(yǎng)基

試驗中用到的培養(yǎng)基包括:LB液體和固體培養(yǎng)基、高氏一號液體和固體培養(yǎng)基、含3%的重鉻酸鉀高氏一號固體培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基和克氏一號瓊脂培養(yǎng)基.

1.1.4 主要試劑

0.10%呂氏堿性美藍(lán)染色液(麥克林)；細(xì)菌基因組提取試劑盒(50次/盒),天根生化科技有限公司；PCR 擴(kuò)增試劑盒及引物購自北京六合華大基因科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 土壤放線菌的分離和純化

采用傳統(tǒng)的梯度稀釋涂布法和劃線分離法篩選和純化土壤放線菌.取10.00 g風(fēng)干過篩處理過的土壤樣品加入裝有90 mL無菌生理鹽水的250 mL錐形瓶中，28℃、150 r/min條件下震蕩培養(yǎng)30 min,靜置30 min后再用無菌生理鹽水稀釋到10-3、10-4和10-5備用.各取上述菌懸液200 μL分別涂布于含有3%重鉻酸鉀的高氏一號固體平板上，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，挑取單菌落轉(zhuǎn)移到無菌高氏一號平板上，再采用區(qū)段劃線法進(jìn)行純化,重復(fù)3次,對獲得的穩(wěn)定菌株進(jìn)行編號并保存.

1.2.2 農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌的篩選

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為供試菌株，采用瓊脂塊法[9]進(jìn)行初篩.瓊脂塊法方便簡潔且便于觀察，適用于大量菌株的初篩，可以大大提高篩選效率.將供試菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)24 h，分離獲得的放線菌涂布于高氏一號固體平板上，28℃培養(yǎng)7 d后，用直徑9 mm無菌打孔器取放線菌菌塊接種于已涂布供試菌株的LB平板上，每塊平板放置2塊～4塊菌塊.每種供試菌株做4個平行.28℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察并測量抑菌圈的大小，采用“十”字法測量抑菌圈直徑，取其平均值.

復(fù)篩采用改良牛津杯法[8].將上述具有較高抑菌活性的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，在28℃和180 r/min條件下震蕩培養(yǎng)8 d，發(fā)酵液4200 r/min離心15 min,再用0.22 μm的濾頭將上清液過濾除菌備用.用直徑為7 mm的無菌打孔器在已涂布供試菌株的LB平板上打孔，去掉瓊脂塊，在孔中加入100 μL無菌發(fā)酵液,做4個平行，28℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小,采用“十”字法測量抑菌圈直徑，取其平均值.

1.2.3 農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)特征觀察

將抑菌活性最強的菌株分別劃線接種于高氏一號瓊脂培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基和克氏一號瓊脂培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)7 d～15 d，觀察營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲顏色及有無可溶性色素.采用插片法觀察菌株在高氏一號培養(yǎng)基上的營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲等特征，其方法為:將菌株涂布接種于高氏一號固體平板上，同時在無菌操作下斜插上3個～4個無菌蓋玻片在平板上,置于28℃恒溫條件下培養(yǎng)8 d后,將蓋玻片取出蓋在滴有0.10%美藍(lán)染液上,用顯微鏡觀察其菌絲情況.

1.2.3.2 生理生化特性

生長溫度測定:培養(yǎng)在高氏一號培養(yǎng)基上的菌體分別在4℃、12℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃培養(yǎng)7 d后測定其生長情況.耐鹽性:除去NaCl的LB液體培養(yǎng)基中加入2%、3%、5%、7%和10%的NaCl液體培養(yǎng)7 d后測定生長情況.生長曲線測定:將菌株接種于裝有150 mL 高氏一號液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,以高氏一號無菌液體培養(yǎng)基為對照,置于28℃和150 r/min條件下培養(yǎng),每隔6 h用722型可見光分光光度計測其OD600處光密度值.每次實驗設(shè)三個平行樣,每個實驗重復(fù)3次,取其平均值.

生理生化特征參照文獻(xiàn)[10-12]進(jìn)行碳源利用產(chǎn)酸、淀粉水解、明膠液化、纖維素水解和黑色素產(chǎn)生等試驗.

1.2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA,再用1.00%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的效果.利用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′) 和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行16 S rRNA基因片段的擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增體系為30 μL:Super Mix 15 μL，Primer F(10 p)1 μL，Primer R(10 p)1 μL，模板(ng/μL)1 μL，ddH2O 12 μL.PCR擴(kuò)增條件為:94℃,5 min；94℃,1 min，58℃,45 s，72℃,1.5 min，共30個循環(huán)；72℃,10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物用1.00%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，后續(xù)的測序工作由北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司完成序列測定.將獲得的測序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST比對,以Blast程序?qū)?shù)據(jù)庫中已登錄的序列進(jìn)行同源性比較分析,采用MEGA 6.0軟件和NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)抗生素放線菌的分離和篩選

從多個點采集的9份土壤中共分離純化獲得46株放線菌.利用瓊脂塊法,經(jīng)初篩獲得20株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有抑菌活性的菌株,經(jīng)過復(fù)篩選,確定具有抑菌活性的菌株有18株,其中,菌株KS7對三株供試菌株的抑菌效果最好,且具有非常高的抑菌活性,其瓊脂塊對大腸桿菌的平均抑菌圈直徑為31.25 mm (菌塊直徑為9 mm)，對金黃色葡萄球菌的平均抑菌圈直徑為29.72 mm (菌塊直徑為9 mm)，對枯草桿菌的平均抑菌圈直徑為35.10 mm (菌塊直徑為9 mm)；菌株KS7無菌發(fā)酵液對三株菌株的平均抑菌圈直徑分別為17.00 mm、19.17 mm和15.43 mm，抑菌效果非常顯著(如下圖1和表1所示),有望用于生物農(nóng)藥的開發(fā).其余菌株的抑菌效果很差,平均抑菌圈直徑均小于13 mm.

圖1 菌株KS7對供試菌株的抑菌效果

表1 菌株KS7對供試菌株的抑菌試驗

2.2 農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

本實驗獲得一株具有高抑菌活性的菌株,其編號為KS7,該菌株在高氏一號平板上生長迅速,菌落呈白色,圓形或不規(guī)則圓形,不易挑起,氣生菌絲白色,基內(nèi)菌絲乳白色,無可溶性色素,顯微鏡觀察菌絲時,可見其氣生菌絲發(fā)達(dá),孢子絲呈螺旋狀(如下圖3所示).菌株KS7在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征詳見表2、圖2和圖4.

表2 菌株KS7在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

圖2 菌株KS7培養(yǎng)14 d后的形態(tài)特征

圖3 菌株KS7的菌絲形態(tài)

圖4 菌株KS7在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的形態(tài)特征

2.2.2 生理生化特性

KS7菌株可在12℃～40℃下生長,其最適生長溫度為25℃～30℃.耐鹽性試驗中在2% NaCl下生長迅速且最好,在3% NaCl環(huán)境中生長較快且良好；在5% NaCl環(huán)境中能生長,但生長很慢;在7% NaCl環(huán)境中生長極慢,肉眼可見極少生長;在10% NaCl環(huán)境中不生長.該菌株在高氏一號液體培養(yǎng)基上生長迅速,在培養(yǎng)100 h時生長量達(dá)到頂點,其生長情況見圖5.KS7菌株生理生化特征詳見表3.

圖5 菌株KS7的生長曲線

表3 KS7菌株與Streptomyces coralus SX92菌株[13]的生理生化特征比較

2.2.3 分子生物學(xué)分析

將KS7經(jīng)測序獲得的16S rRNA基因序列結(jié)果 (1420 bp) 放到NCBI中進(jìn)行相似性比對,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖6) ,其結(jié)果表明，KS7與登錄號為MH265970.1的Streptomycescoralus(珊瑚鏈霉菌)相似性最高，高達(dá)99.64%，確定KS7菌株為Streptomyces.

圖6 基于菌株KS7的 16S rRNA 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

作為重要生物資源的放線菌,一直備受科研人員們的關(guān)注.最先對放線菌進(jìn)行研究是以挖掘抗生素來解決人類的健康問題,之后才把目光放到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上.目前,對放線菌研究的熱點主要為新藥的開發(fā)、海洋放線菌的抗菌作用和抗腫瘤活性物質(zhì)[14]、生防菌劑的開發(fā)等方面[15],尤其是生防菌劑——拮抗和促生放線菌的研究方面是近年來的一大熱點.

本文從隴南成縣多點采集土樣,共獲得46株放線菌,利用瓊脂塊法和改良牛津杯法經(jīng)過初篩和復(fù)篩,發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生抑菌活性的菌株有18株,其中絕大部分放線菌的抑菌活性均很弱,抑菌圈直徑均小于13 mm,只有一株KS7菌株抑菌活性最強,且抑菌活性非常高.菌株KS7對枯草芽孢桿菌的抑菌活性最強,平均抑菌圈直徑高達(dá)35.10 mm;其次是大腸桿菌,平均抑菌圈直徑為31.25 mm;對金黃色葡萄球菌的抑菌活性差一些,平均抑菌圈直徑也達(dá)29.72 mm；該菌株無菌發(fā)酵液抑菌活性相較于其菌塊弱一些,上述三株供試菌株抑菌圈平均直徑分別為15.43 mm、17.00 mm和19.17 mm.可見無菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌抑菌活性最強.綜上可見,菌株KS7具有較強的抑菌效果,有望于農(nóng)用抗生素方面的研究.通過菌種特性、菌落形態(tài)特征以及對其基因序列16S rRNA分析,將菌株KS7鑒定為鏈霉菌屬(Streptomyces).該菌株與Streptomycescoralus相似性最高,而目前關(guān)于珊瑚鏈霉菌(Streptomycescoralus)的研究報道比較少.陳奇園等[13]2019年報道了從洛陽煙區(qū)煙株根圍土壤中分離到的一株珊瑚鏈霉菌(S.coralusSX92),與本文獲得的菌株KS7的16S rRNA基因相似性為99.64%,生理生化特性和菌落特征接近,但在菌落形態(tài)和生理生化特性上仍存在部分差異.