鄭如潔， 李佳琦， 廖 燁， 魏麗欽， 黃欽鳳， 陳 輝

高位脊髓損傷(spinal cord injury， SCI)在創(chuàng)傷早期常常出現(xiàn)多系統(tǒng)多器官的并發(fā)癥，且多以心血管功能異常為死亡的首要原因，顯著增加了這類患者手術(shù)及麻醉的風(fēng)險(xiǎn)，繼發(fā)心血管功能異常，增加其致死率[1-2]。多項(xiàng)研究[3-4]證實(shí)，高位SCI早期存在心肌損傷。前期研究[5]已發(fā)現(xiàn)，高位SCI大鼠早期心肌存在葡萄糖代謝異常，表現(xiàn)為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4， GLUT4)膜轉(zhuǎn)位減少。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/glucose transporter 4， PI3K/AKT/GLUT4)信號(hào)通路作為胰島素主要的下游分子通路，是調(diào)控細(xì)胞能量代謝的重要途徑。在心肌葡萄糖代謝過程中，胰島素是主要調(diào)控激素，其通過與細(xì)胞膜表面的胰島素受體結(jié)合，激活下游PI3K/AKT通路，促進(jìn)GLUT4轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，增加葡萄糖攝取，發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝的作用[6]。高位SCI早期GLUT4減少是否是PI3K/AKT/GLUT4通路上游表達(dá)受損導(dǎo)致，目前未知，正是本研究所要探討的問題。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性 SD 大鼠30只，8～10周齡，體質(zhì)量 250～300 g，購于福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào)：SCXK(閩)2016-0002。所有動(dòng)物均在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)學(xué)校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：IACUC FJMU 2022-0487)。

1.2動(dòng)物分組及處理 采用隨機(jī)數(shù)字法分為五組(每組n=6)：假手術(shù)組(Sham組)、高位SCI后4 h組(SCI 1組)、高位SCI后12 h組(SCI 2組)、高位SCI后24 h組(SCI 3組)和高位SCI后48 h組(SCI 4組)。建模前為大鼠提供正常舒適飼養(yǎng)條件，并記錄大鼠飲食及排泄情況。術(shù)前大鼠禁食 8 h，禁飲1 h，稱質(zhì)量。麻醉采用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射[7]，起效后，大鼠俯臥位固定于鼠臺(tái)上，稍墊高頸背部，備皮，以C7棘突(棘突最高處)為中心做正中切口，做標(biāo)記，10%活力碘消毒3遍。縱行切開皮膚及皮下組織，暴露 C6～T1棘突及椎板。用持針器咬除C7棘突及全椎板，顯露其下方白色硬脊膜和脊髓。打擊脊髓采用改良的Allens打擊法，10 g砝碼從5 cm高的中空玻璃管內(nèi)垂直下落撞擊脊髓1次。Sham組只顯露 C7硬脊膜和脊髓，不打擊。實(shí)時(shí)造模成功的標(biāo)志：打擊后大鼠的雙下肢回縮性撲動(dòng)，尾巴可呈痙攣性擺動(dòng)，撞擊處脊髓由白色變灰暗。致傷后用明膠海綿徹底止血，逐層縫合肌肉和皮膚。建模前后的大鼠均需進(jìn)行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評(píng)分量表評(píng)估，建模前各組大鼠評(píng)分<21分及蘇醒后評(píng)分>1分的大鼠排除使用。術(shù)后觀察記錄蘇醒時(shí)間，給予液體治療(腹腔注射生理鹽水40 mL/kg)，抗感染治療(肌注青霉素20萬U，2次/d)，截癱護(hù)理(人工排尿排便3次/d，膀胱按摩)，記錄排尿排便情況。建模成功大鼠分別于脊髓打擊后4、12、24和48 h進(jìn)行BBB評(píng)分并取材。

1.3透射電鏡 切取1 mm×1 mm×1 mm心肌組織，用pH為7.2的3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1 mmol/L PBS固定，漂洗，用1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀再固定，再漂洗、脫水、浸透包埋后切片染色，Philips EM 208型透射電鏡觀察并攝片。

1.4Western blot法 組織塊剪成小塊，制成勻漿，12 000 r/min離心10 min后收集上清，即為總蛋白溶液，膜蛋白用膜蛋白提取試劑盒提取。BCA法測(cè)定蛋白濃度。取10 μL樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，將 PVDF 膜用5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h，分別加入兔抗PI3K p85和兔抗P-AKT(稀釋度為1∶1000，Abcam，英國)，溫育1.5 h。用TBST洗3次。加入山羊抗兔IgG(稀釋度為1∶1000，Sigma，美國)，溫育1.5 h。經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯影曝光后，以GAPDH做內(nèi)參，采用Image J軟件測(cè)定目標(biāo)帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1術(shù)后表現(xiàn)及BBB評(píng)分結(jié)果 Sham 組大鼠術(shù)后四肢靈活，活動(dòng)和進(jìn)食等行為均與術(shù)前基本一致，BBB評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)值21分。SCI 各組大鼠術(shù)后雙下肢呈弛緩性癱瘓，活動(dòng)和進(jìn)食均較術(shù)前明顯減少，無自主排尿排便, 各組BBB評(píng)分均降低，在傷后12 h內(nèi)評(píng)分均為0分,傷后24 h和48 h可見評(píng)分稍有升高。SCI各組BBB評(píng)分與Sham組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠BBB評(píng)分比較[M(P25，P75)，n=6]

2.2透射電子顯微鏡觀察心肌細(xì)胞改變 Sham組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；SCI各組心肌細(xì)胞存在不同程度的肌絲溶解、肌漿網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞間隙增寬、溶酶體增多和線粒體結(jié)構(gòu)破壞等變化。見圖1。

Sham組 SCI 1組 SCI 2組 SCI 3組 SCI 4組 注：Sham組為假手術(shù)組；SCI 1組為高位SCI后4 h組；SCI 2組為高位SCI后12 h組；SCI 3組為高位SCI后24 h組；SCI 4組為高位SCI后48 h組；Sham組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致正常；SCI 1組大多數(shù)細(xì)胞未見異常改變，僅少量心肌細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化，偶見肌漿網(wǎng)擴(kuò)張；SCI 2組線粒體腫脹，嵴稀疏化，肌絲溶解；SCI 3組線粒體腫脹破壞，呈空泡樣改變，肌絲溶解；SCI 4組細(xì)胞腫脹，部分壞死脫落，線粒體漏出，肌絲廣泛性溶解

2.3蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)PI3K、p-AKT和GLUT-4 與Sham組比較，SCI 1組、SCI 2組和SCI 3組心肌組織PI3K和p-AKT含量降低(P<0.05)，其中SCI 1組和SCI 2組含量顯著下降(P<0.01)，于傷后48 h基本恢復(fù)正常。與Sham組比較，SCI 1組、SCI 2組和SCI 3組心肌細(xì)胞膜 GLUT-4 含量降低(P<0.05)，其中SCI 3組降至最低(P<0.01)，而SCI 4組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2、表2。

注：PI3K為磷脂酰肌醇3-激酶；p-AKT為磷酸化蛋白激酶B；GLUT4為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4

表2 各組大鼠心肌組織PI3K、p-AKT和心肌細(xì)胞膜GLUT4含量

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用改良的Allens打擊法建立高位SCI模型。術(shù)后大鼠雙下肢呈弛緩性癱瘓，BBB評(píng)分趨近于0分，表明高位SCI大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能嚴(yán)重受損，建模成功。電鏡下可觀察到心肌細(xì)胞出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)破壞，表現(xiàn)為肌絲溶解、閏盤連接分離、肌漿網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞膜部分破裂溶解、線粒體腫脹嵴稀疏等，證明高位SCI早期存在心肌細(xì)胞損傷，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠高位SCI早期心肌PI3K和p-AKT表達(dá)降低，心肌細(xì)胞膜GLUT4含量減少，說明PI3K/AKT/GLUT4信號(hào)通路存在異常。

磷脂酰肌醇3-激酶家族(PI3Ks)通過磷酸化磷脂酰肌醇和磷酸肌醇的3′-羥基參與調(diào)控細(xì)胞代謝、生存和囊泡運(yùn)輸?shù)榷喾N生理過程。根據(jù)作用底物和序列同源性的不同，PI3Ks可分為Ⅰ型PI3Ks、Ⅱ型PI3Ks和Ⅲ型PI3Ks[8]。Ⅰ型PI3Ks又分為ⅠA和ⅠB兩種亞型，其中ⅠA亞型是由一個(gè)p85調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)p110催化亞基組成的異質(zhì)二聚體；調(diào)節(jié)亞基p85可以直接與細(xì)胞膜上的酪氨酸受體，如胰島素受體底物1結(jié)合后，激活催化亞基p110，實(shí)現(xiàn)信號(hào)向下游通路的傳遞[9]。Luo等[10]通過構(gòu)建PI3K p85亞基敲除大鼠模型，發(fā)現(xiàn)PI3K信號(hào)分子受損會(huì)引起骨骼肌胰島素抵抗和全身葡萄糖耐受不良，表明PI3K p85亞基是調(diào)節(jié)能量代謝的重要分子。AKT是位于PI3K信號(hào)通路下游的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，磷酸化后作用于AKT的底物160 kDa，驅(qū)動(dòng)GLUT4轉(zhuǎn)位，促進(jìn)葡萄糖攝取。研究證實(shí)敲除AKT可以抑制胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取，而AKT過表達(dá)則會(huì)增加葡萄糖攝取，表明AKT是葡萄糖攝取的重要分子[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高位SCI 后24 h內(nèi)，p-AKT均呈低表達(dá)，與上游PI3K蛋白低表達(dá)存在一致性，證實(shí)是上游PI3K表達(dá)下調(diào)引起信號(hào)傳導(dǎo)受損，致AKT磷酸化水平降低。

前期研究已證實(shí)，高位SCI后大鼠心肌存在能量代謝障礙，表現(xiàn)為GLUT4轉(zhuǎn)位減少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致。GLUT4是心肌中主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖[12]。細(xì)胞膜GLUT4含量減少，即GLUT4轉(zhuǎn)位減少。有研究[13]顯示，PI3K及AKT抑制劑分別抑制PI3K和AKT表達(dá)后，心肌細(xì)胞GLUT4的轉(zhuǎn)位顯著下降，葡萄糖攝取顯著減少，表明PI3K和AKT是GLUT4轉(zhuǎn)位的重要調(diào)控分子。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PI3K和AKT蛋白在高位SCI 后表達(dá)下調(diào)，這與GLUT4轉(zhuǎn)位降低基本一致，證明PI3K/AKT/GLUT4通路存在異常，上游PI3K和AKT表達(dá)下調(diào)可能是GLUT4轉(zhuǎn)位減少的機(jī)制之一。PI3K、p-AKT和心肌細(xì)胞膜GLUT4含量在傷后24 h內(nèi)降低，但后者與前兩者降低趨勢(shì)不完全一致，考慮可能與腺苷酸-活化蛋白激酶(AMPK)的激活有關(guān)。AMPK是心肌重要的能量感受器和代謝調(diào)節(jié)中心。當(dāng)心肌能量需求增加時(shí)，AMP與ATP比值增加激活A(yù)MPK，后者激活A(yù)KT的底物160 kDa和TBC1D1，促進(jìn)GLUT4囊泡向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，誘導(dǎo)GLUT4轉(zhuǎn)位增加；另一方面，AMPK也能抑制細(xì)胞膜上GLUT4的內(nèi)吞循環(huán)，進(jìn)一步增加具有活性的GLUT4含量[14-15]。目前研究認(rèn)為，AMPK通路是心肌應(yīng)激性適應(yīng)的保護(hù)機(jī)制，在心肌缺血等病理情況下被激活。Russell等[16]發(fā)現(xiàn)，缺血心肌氧化代謝受損，AMPK活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)GLUT4轉(zhuǎn)位，通過不依賴PI3K的途徑促進(jìn)葡萄糖代謝，表明AMPK是受損心肌的重要保護(hù)機(jī)制。故本實(shí)驗(yàn)猜測(cè)高位SCI大鼠心肌也存在同樣的代償機(jī)制，從而出現(xiàn)傷后24 h內(nèi) PI3K、p-AKT與下游GLUT4降低趨勢(shì)不完全一致的現(xiàn)象。需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

PI3K和AKT在葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)位中起著至關(guān)重要的作用。在早期研究中，PI3K抑制劑如渥曼青霉素可以完全阻斷胰島素對(duì)葡萄糖攝取的刺激[17];同時(shí)，另一研究[14]也證實(shí)渥曼青霉素顯著降低了葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)位，均表明PI3K是胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的。AKT作為PI3K的直接下游靶點(diǎn)，通過構(gòu)建和使用AKT的抑制劑，幾乎完全抑制了胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位[19]；而無活性AKT突變體的過表達(dá)，同樣顯著降低了胰島素介導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位[20]。以上均證實(shí)PI3K和AKT與GLUT4轉(zhuǎn)位關(guān)系密切。故在本研究中未使用PI3K和AKT抑制劑再次驗(yàn)證其關(guān)系。

Duckworth 等[21]發(fā)現(xiàn)，高位SCI 患者血漿胰島素水平升高，出現(xiàn)胰島素抵抗和糖耐量異常，但胰島素與受體結(jié)合量無明顯差異，說明該類患者胰島素抵抗為胰島素與受體結(jié)合后的信息傳導(dǎo)異常。本研究結(jié)果與此一致，說明PI3K/AKT/GLUT4通路相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，與心肌胰島素抵抗有關(guān)。在葡萄糖代謝的分子機(jī)制中，PI3K/AKT/GLUT4通路作為其關(guān)鍵途徑，該通路上任一分子受損均可引起胰島素級(jí)聯(lián)反應(yīng)減弱或中斷，進(jìn)而產(chǎn)生胰島素抵抗。心肌出現(xiàn)胰島素抵抗時(shí)，葡萄糖攝取量顯著減少，使以葡萄糖為能量底物的一系列氧化分解速率顯著降低，心臟功能受損[22]。另有研究證實(shí),心肌AKT表達(dá)下調(diào)會(huì)減少葡萄糖的攝取和ATP的產(chǎn)生，出現(xiàn)胰島素抵抗，證明AKT通路與心肌胰島素抵抗關(guān)系密切；研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)心肌收縮和舒張功能均有一定程度受損，而上調(diào)AKT的表達(dá)可以改善葡萄糖攝取和能量供用，有利于心肌功能的恢復(fù)[23]。以上均證實(shí),PI3K/AKT/GLUT4通路的異常與心肌損傷密切相關(guān)。如何上調(diào)高位SCI早期PI3K/AKT/GLUT4通路，進(jìn)而改善胰島素抵抗達(dá)到心肌保護(hù)的作用，也將是我們未來研究的方向。

本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于未能檢測(cè)大鼠血中血糖水平及心肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取率，以進(jìn)一步佐證GLUT4轉(zhuǎn)位減少所致的糖代謝異常。

綜上所述，大鼠高位SCI早期心肌細(xì)胞GLUT4減少可能與PI3K/AKT/GLUT4信號(hào)通路上游表達(dá)異常有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。